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Identification of emetic toxin producing Bacillus cereus strains by a novel molecular assay

一种新的分子鉴定方法对产吐毒素蜡样芽孢杆菌的鉴定

原文链接： https://sci-hub.se/10.1016/S0378-1097(04)00066-7

蜡样芽孢杆菌引起胃肠道疾病有两种类型：呕吐和腹泻。呕吐类型是由耐热的麦角肽引起的，症状类似于金黄色葡萄球菌中毒，但目前还没有一种快速的方法来检测引起这类疾病的蜡样芽胞杆菌菌株。本研究鉴定了一条功能未知的聚合酶链反应(PCR)片段，该片段对蜡样芽胞杆菌产吐毒素菌株具有特异性。测定了该扩增产物的序列，并在此基础上建立了PCR检测方法。对来自不同食物源、不同地理位置的100株蜡样芽胞杆菌和29株蜡样芽胞杆菌进行了检测。此外，49个非B类。以食源性致病菌为主的蜡样群菌株的检测结果表明，该方法对产吐毒素的蜡样芽胞杆菌有较好的特异性。PCR法是第一个快速检测产吐毒素蜡样芽胞杆菌的分子方法。

开发分子工具对于快速鉴定临床分离的蜡状芽胞杆菌的毒力机制是必要的。腹泻中毒是由小肠中蜡样芽胞杆菌营养生长过程中产生的不耐热肠毒素引起的，而呕吐型食物中毒是由耐热和酸性稳定的环状十二烷基小肽小脑引起的。虽然肠毒素在分子和表达水平上都有较好的特征，但对引起毒素呕吐的了解却少之又少。对小脑的化学结构和性质进行了较详细的研究，但其合成的分子基础尚不清楚。

蜡质芽孢杆菌是方便食品和大规模饮食供应中的一个主要问题。由于其芽孢的耐热性和耐酸性，它不能通过巴氏杀菌或卫生程序消除。蜡样芽胞杆菌是一种普遍存在的孢子原，不能完全避免，因此有必要建立快速鉴别有害菌株和无毒菌株的方法。1999年NCCLS发布的指南显示了基于聚合酶链反应(PCR)的方法的实用性，该指南鼓励在进行细菌鉴定的临床实验室中使用分子方法。这样的分析也有利于食品工业的质量控制，并能大大提高食品安全。而对于肠毒素蜡样杆菌菌株，分子诊断PCRass已被描述和商业免疫学检测可用，对于催吐菌株，这类工具仍然缺乏。所提出的PCR系统可通过提供一种快速检测产吐毒素的蜡样芽胞杆菌菌株的分子检测方法来弥补这一差距。

一株催吐型蜡样芽胞杆菌基因组DNA片段的鉴定：以NRPS基因保守序列为靶序列的简并引物，在PCRbased筛选实验中，从催吐型B中扩增出700bp和800bp两条不同的条带。非催吐型蜡样芽胞杆菌菌株只有一条带(700bp). 从产B的蜡质中扩增出大小为800 bp的片段。对蜡质菌株F4810/72进行了克隆和序列测定。利用BLAST进行的数据库搜索发现，该基因组DNA片段与AMP结合基因和乙酰辅酶A合成酶的同源性较弱，但与非核糖体多肽合成酶的同源性不高。根据该基因组DNA片段的序列设计寡核苷酸引物，从产吐毒素的蜡样芽胞杆菌菌株中扩增鉴定出的DNA片段。对10株致吐菌株的PCR扩增产物进行测序，发现所有菌株的序列完全相同。随后，该序列信息被用于产生一个260-bp的探针进行Southern分析，并建立了一种基于PCR的检测方法。选取呕吐和非呕吐的菌株，通过Southern杂交检测其是否存在已鉴定的DNA片段。地高辛标记的DNA探针仅与吐气性蜡样芽胞杆菌分离株的DNA杂交，而非催吐性蜡样芽胞杆菌菌株或其他细菌的DNA均未检测到杂交信号.

PCR检测方法的评价使用来自临床病例、食品和环境的100株蜡样杆菌菌株的面板来评估该检测方法的特异性：设计的寡核苷酸引物对蜡样芽胞杆菌组的近亲成员以及其他细菌和已知的食品致病菌进行了交叉反应试验。共分析了178株来自不同细菌种的细菌。结果表明，该方法对致吐菌株具有较高的特异性。30株产生蜡样芽孢杆菌的菌株中有30株被检测到，而在PCRass中没有一株非产生蜡类化合物的菌株发出任何信号。为了证明PCR抑制物质的缺乏或PCR检测的任何不足，将选定的菌株与针对16S rDNA基因的通用引物(图1)进行了平行扩增。与呕吐样菌株无交叉反应，与呕吐类菌株具有相同的生化特性。最近的研究表明，这些不产生脑磷脂的菌株通过遗传和表型方法与催吐剂菌株聚在一起。

从呕吐参考菌株F4810/72的纯化基因组DNA中提取10倍连续稀释液，测定其灵敏度。检测下限为2.5pg模板DNA，相当于约500个蜡样芽孢杆菌基因组拷贝数。为了提高检测的灵敏度，增加了循环次数。在40个循环的PCR中，我们观察到在过量的DNA(200 Ng)存在下，对非吐气性蜡样芽胞杆菌菌株的检测限为2PgDNA。

图2.筛选菌株的Southern杂交分析。用高致病性纤溶酶原激活剂(HPAI)对基因组DNA进行限制性内切酶(HPAI)扩增，并与一个260 bp的探针进行杂交，该探针的目的是针对致吐的蜡样芽胞杆菌的DNA片段。共检测到14株细菌：蜡样芽胞杆菌6株(4株催吐性菌株，1株吐气样菌株，2株非吐气性菌株)，魏氏杆菌WSBC10204T和苏云金杆菌WS2734T，枯草杆菌WS1525T，地衣芽孢杆菌WSBC23001，短链球菌ATCC9999，金黄色葡萄球菌WS2604和WS2608，小肠结肠炎杆菌WS2589。显示了选定的芽孢杆菌菌株。通道1、2、7和8，非吐气性蜡样芽胞杆菌群菌株；通道3和4，催吐性蜡样芽胞杆菌菌株；车道5，吐气性蜡样芽胞杆菌菌株；车道6，B.brevis；M，标记DNA分子质量标记VII，地高辛标记(罗氏)。第四车道的信号比第三车道的信号弱，这是因为第四车道的DNA浓度较低，这是通过用通用的16SrDNA探针重新探测印迹来确定的。

图3.聚合酶链反应(PCR)的种属鉴定方法检测蜡样念珠菌的研究。<br/>PCR产物经引物扩增后的电泳图谱：EM1F+EM1R(上半部)和826/56+15111493(下半部)来自不同食品致病菌的纯化DNA。第二组引物为826/56+15111493，来自大肠杆菌[28]的16SrDNA。非吐气性蜡样芽胞杆菌菌株ATCC14579T；从病人呕吐物(食物中毒)中分离到的B·蜡样芽孢杆菌F4810/72、从食物中分离到的B·蜡样吐物菌株、从食物中毒残留物中分离到的B·蜡样呕吐菌株、从食物中分离到的B·蜡样呕吐菌株、B·anthracis Sterne、CIP7702、B·CIP7702；7，肠炎链球菌WS2863；8，金黄色葡萄球菌WS2608(SEC)；9，大肠杆菌WS2577(EHEC)；M，标记100-BP阶梯(PROMEGA)。

当靶核酸由蜡样芽胞杆菌组成员的染色体DNA或食源性病原体混合的染色体DNA组成时，引物EM1F和EM1Rampli仅在催吐性蜡样芽胞杆菌DNA存在的情况下才扩增出一段片段。最后，用一株非呕吐性菌株的模板DNA和10倍系列稀释度的蜡样念珠菌的模板DNA进行PCR。在40个循环的PCR中，我们观察到在过量的DNA(200 Ng)存在下，对非吐气性蜡样芽胞杆菌菌株的检测限为2PgDNA。

讨论根据其结构和功能，催吐毒素Cereulide可由NRPS酶促合成，类似于其它天然多肽和脱辅肽。因此，利用简并引物对已知的NRPS序列进行PCR筛选。在这一方法中，我们获得了一个基因组DNA片段，该片段在产吐毒素的蜡状芽孢杆菌菌株中特异性存在。令人惊讶的是，该片段的序列与数据库中的NRPS序列没有同源性。该基因组DNA片段的编码潜力尚不清楚，因为使用BLAST进行同源搜索后发现，该片段与数据库中的其他序列没有明显的同源性。经Southernblot杂交、测序蜡样杆菌和炭疽杆菌基因组分析以及178株细菌的PCR检测表明，该基因组DNA片段为产吐毒素B的特异性DNA片段。因此，该序列被用来建立一种基于PCR的检测产吐毒素的蜡样芽孢杆菌分离株的分子检测方法。这种简便、快速的PCR检测方法是一种很有吸引力的替代方法，可用于检测产生呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌。目前，检测催吐毒素有三种可能：通过细胞毒性、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)和使用基于精子的生物测定，这些检测很难在常规的基础上进行，需要一天到一周的预培养和艰苦的样品准备。

图4.。用从混合微生物模板DNA中提取的吐痰菌SPECSPEC引物对EM1F和EM1R进行PCRampli扩增产物的凝胶电泳分析。Line1，蜡样芽胞杆菌组成员DNA的混合物(蜡样芽孢杆菌ATCC 14579T，炭疽杆菌B.anthracis Sterne，CIP7702，苏云金杆菌WS2614，魏氏杆菌WSBC10204T，霉菌WSBC10276，假真菌B.Pseudomycoides WS3118T)；(2)CIP7702，SIP7702，WS2614，WSBC10204T，WSBC10276，WS3118T；第2巷，混合蜡样芽孢杆菌DNA(与第1车道相同)，包括催吐性参考菌株蜡状芽孢杆菌F4810/72；第3车道，来自金黄色葡萄球菌菌株的DNA混合物(金黄色葡萄球菌WS2604(SEA)、WS2606(SEB)、WS2608(SEC)、SEA(SEA)、WS2606(SEB)、WS2608(SEC)、WS2604(SEB)、WS2608(SEC)、。WS2610(SED)，WS2612(见)，第4车道，与第3车道相同的混合物，包括蜡样芽孢杆菌F4810/72；Line5，食物致病菌的DNA混合物(地衣芽孢杆菌WSBC23001，产气荚膜梭菌ATCC 3628，单核细胞增生李斯特菌WSLC10209，金黄色葡萄球菌WS2604，平等链球菌WS2733，肠球菌血清型都柏林WS2692，大肠杆菌WS2577，小肠结肠炎杆菌WS2589)，第6巷，与包括蜡样芽孢杆菌F4810/72在内的第5巷相同；莱恩7，蜡笔菌F4810/72；M：标记100-BP阶梯(PROMEGA)。DNA混合物的制备见第2节。

应用PCR试验，在高本底微生物区系中特异性地检出了致吐物蜡样芽胞杆菌。引物的耐受性对食品中蜡样芽胞杆菌的直接检测具有重要意义。蜡样芽孢杆菌食物中毒往往是食品贮存不当的结果，因此在食品样品中可能会出现较高的微生物背景菌群。目前正在研究所开发的PCR系统在食品中直接检测蜡样芽胞杆菌的潜力，所述引物系统的普遍适用性正在一个常规实验室中进行测试。

蜡样芽胞杆菌引起的胃肠道疾病在症状上类似于其他类型的食物中毒。蜡样芽胞杆菌引起的呕吐不能从肠毒素金黄色葡萄球菌中毒症状中鉴别出来。只有2%(1/50)的食物中毒病例怀疑是金黄色葡萄球菌引起的。在检测金黄色葡萄球菌方面，已介绍了以不同基因为靶标的分子检测方法，所提出的PCR方法是目前最适合于止吐的蜡样芽胞杆菌的分子检测方法。

总之，我们已经开发了一种高灵敏度和测试菌株特异性的分子检测方法，可以快速检测产生呕吐毒素的蜡状芽孢杆菌菌株。此外，本文提出的基于PCR的检测系统将有助于发展多重PCR系统，用于检测蜡样芽胞杆菌引起的胃肠道疾病的全部毒素基因。这种分子检测也可能有助于阐明肠毒素和产生呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌在非肠道感染中的作用。这项工作得到了欧洲联盟委员会的支持(QLK1-CT-2001-00854)。