3a-Hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni: biological significa

3a-Hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni: biological significance,three-dimensional structure and gene regulation

CT菌中3α-羟类固醇脱氢酶/羰基还原酶：生物学意义，三维结构和基因调控

摘要：

在睾丸酮丛毛单胞菌，3a-HSD/CR催化的氧化还原反应在甾体激素的碳3位置，启动该甾核完全矿化为CO 2和H 2O。发现该酶可以作用于多种甾体底物，包括类固醇抗生素梭链孢酸。该酶还可以催化的醛和酮等非甾体类的羰基还原，如新型杀虫剂。3a-HSD/CR 有助于CT菌抑制天然和合成的有毒物质的重要防御策略。3a-HSD/CR结构基因为774bp，编码258个氨基酸残基，分子量大小为26.4 kDa。同源性调查发现3a-HSD/CR为短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族的新成员。根据凝胶渗透色谱法纯化的酶为49.4 kDa的蛋白，提出3a-HSD/CR二聚性。使蛋白质结晶，并通过X射线分析其结构。晶体结构揭示了不对称单位的每一个同型二聚体，从而验证其聚体性质。3α-HSD/CR酶为二聚体结构，通过亚基的螺旋αG和βG界面发生二聚作用。到目前为止，这种分子间的接触是在同源四聚体SDR中唯一可以被观察到，但不是同源四聚体SDR的结构。一个四聚体的形成是通过一个显著a-螺旋阻断3a-HSD/CR，错过所有已知的SDR的结构。启动子区域位于hsdA区域内上游93 bp ，转录起始位点在翻译起始位点上游28 bp确定。有趣的是，hsdA表达被发现是负控制下，由两个阻遏蛋白，发现其基因在相反方向的下游或重叠。根据我们的结果，在CT菌中通过激素诱导hsdA表达，通过防止阻遏蛋白结合抑制调控区域。©2001 Elsevier科学爱尔兰有限公司保留所有权利。

1、介绍

微生物能够利用各种天然甾体，包括胆固醇和植物甾醇，β-谷甾醇、豆甾醇和油菜籽固醇，作为碳源和能源的性质是比较普遍的。完全同化这些基质是通过一个自适应的复杂的代谢途径，涉及多个酶的氧化反应的氧化分解的类固醇核的分解。

从不同土壤样品中分离睾丸酮丛毛单胞菌，该菌在一些工作中已经出现类固醇诱导的特性。因此，一些类固醇代谢酶，以及类固醇结合或运输活动已被描述。

在以前的调查中，编码3α-HSDA的基因被克隆并在大肠杆菌中表达，通过亲和层析色谱法组氨酸标记蛋白纯化。酶被发现为作用于多种甾体底物的氧化还原酶，包括类固醇抗生素梭链孢酸。酶还可以催化的醛和酮等非甾体类羰基还原如新型杀虫剂。根据这些多能干细胞底物特异性激素和非甾体类羰基化合物，这种酶被命名为3α-羟类固醇脱氢酶/羰基还原酶（3a-hsd／CR）。3a-HSD/CR 有助于CT菌抑制天然和合成的有毒物质的重要防御策略。

经凝胶渗透色谱纯化的酶洗脱液为49.4 kDa的蛋白，首次揭示了CT菌中3a-HSD/CR 二聚体性质。根据其一级结构和二级结构一致序列3a-HSD/CRa-HSD/CR为短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族的新成员。

从CT菌中被发现的3a-HSD/CR是可诱导的，通过睾酮和孕酮。然而，直到现在，即没有3a-HSD/CR基因的表达规律，也没有完整可行的类固醇降解调控途径。在这里，细菌类固醇诱导机制，相对应在脊椎动物中是值得怀疑的，其中甾体诱导复合物与相应的受体结合后，激素应答元件（HRES），作为靶基因表达的转录激活因子。应该强调的是，类固醇在某些原核生物发挥特别重要的作用，因为他们可以同时作为信号分子和碳源。

本文综述了3a-HSD /CR近期的数据，在三维结构及其转录调控提供了一些有趣的功能。

2、催化活性

2.1 甾类化合物的氧化还原——提升抑制甾类抗生素

甾类化合物的微生物降解是由C3羟基氧化，随后C5，C6位置双键异构化。类固醇的C17侧链断裂，通常是平行的环核降解的C1，C2位置–脱氢发起，和C9位置羟基化。这些变化导致的B环开口并伴随共存的A环芳构化产生9,10-开环甾类化合物衍生物。最后，对类固醇分子的完全降解产生的CO2和H2O。

3a-HSD/CR催化的氧化还原反应在甾体激素C3位置，用来启动该甾核的矿化。通过这次活动，CT菌中3a-HSD/CR生长过程中，激素为唯一碳源和能源提供依据。在以前的调查中，我们发现这种酶是功能对多种甾体底物，包括雄烯二酮，5a-双氢睾酮，雄甾酮和胆酸。有趣的是，类固醇抗生素梭链孢酸，真菌的梭链孢属分泌的产物，原来是3a-HSD的一个基质，Km值为6.1uM。因此，除了其在能源和碳源捕获作用，3a-HSD/CR可以作为梭链孢酸的起始酶代谢降解，从而为CT菌构成一个重要的防御战略抑制自然发生的甾体类抗生素。事实上，有睾酮存在的CT菌增长导致抗梭链孢酸生长5-6倍提高。

2.2非甾体羰基降解-保护天然和合成的有毒物质？

在真核生物代谢的内源性和外源性化合物中，醛酮和它们相应的醇代谢物的羰基还原是一个重大的生物转化步骤。在真核生物中，由此产生的羟基衍生物，随后与葡萄糖醛酸，磷酸或硫酸结合，因此，更容易消除。然而，在原核生物中，对该代谢途径的生物学意义的信息是有限的。早期的研究中，我们已经表明，3a-HSD/CR能够催化新型防虫剂NKI 42255羰基还原，除此之外，还有其他的类型底物如美替拉酮，对硝基苯甲醛和对硝基苯乙酮。在NKI42255的情况下，短期毒性实验证明产生的酒精是显着减少有毒，从而揭示3a-HSD/CR与这防虫剂重要的防御酶。这也证实了在体内的研究，其中CT菌的细胞表现出显着更快的吸收和代谢睾酮诱导后NKI 42255。

3、3a-HSD/CR为短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族的新成员

3a-HSD/CR从CT的二维凝胶电泳鉴定为睾酮表达上调。在氨基末端的28个氨基酸序列，通过Edman降解法测定，证实了我们先前的结果，从CT中纯化的酶的活性形式。该基因编码3a-HSD/CR定位在一个5.257 kb的EcoRI片段CT菌染色体DNA和编码258个氨基酸残基，分子量大小为26.4 kDa。同源性调查发现3a-HSD/CR是新成员的SDR家族，氨基酸序列高度保守。SDR超家族两个序列的发现，N-末端gly-x-x-x-gly-x-gly辅因子结合基序和tyr-x-x-x-lys段SDR蛋白的催化活性必不可少。有趣的是，不同于其他的SDR蛋白质，活性部位的丝氨酸残基，被发现的41个残基的tyr-x-x-x-lys模体的上游。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示3a-HSD/CR的一个组成部分，近似分子量在26–27 kDa之间，编码26.4 kDa氨基酸序列。然而，在凝胶渗透色谱法纯化的酶洗脱液为49.4 kDa的蛋白，首次揭示了3a-HSD/CR C.睾丸酮二聚体性质。

3a-HSD/CR编码氨基酸序列与等效Pseudomonas sp. strain B-0831中的3α-hsd 比较，都显示了CT菌HSDs与SDR蛋白明显的相关性，所呈现出的特点tyr-x-x-x-lys，gly-x-x-x-gly-x-gly共基质底物结合基序。然而，残留的身份是仅在50%的水平，这表明，这2种酶构成单独的实体，不被视为从相应的基因的变种。

4、CT菌中3a-HSD/CR的三维结构

4.1 全部结构和拓扑学

尽管事实上，这个家族的成员之间的氨基酸身份仅在15–30%的范围内，他们发现在他们的三级结构惊人的相似。他们的整体结构是基于一个典型的二核苷酸结合基序或由βaβ组成的Rossmann折叠，建立一个平行的β-折叠片，在两列平行a-螺旋之间。大部分SDR酶可以是二聚体或四聚体，需要NAD（H）或NADP（H）作为辅助因子。

可能所有的SDR共享一个共同的反应机理，即与辅助因子先结合的强制命令途径。对羟基或羰基底物结合，所谓的底物结合的循环，这在大多数载脂蛋白SDR是高度灵活的，变得井然有序，覆盖基质以及水环境的催化中心。

提出SDR酶的反应机理，保守的酪氨酸作为催化基质，由相邻的质子化的赖氨酸残基提供便利，降低了酚酪氨酸羟基的pKa，而辅因子烟酰胺环是前S氢转移。在大部分SDR蛋白、丝氨酸羟基似乎能够形成氢键的反应产物（如小鼠肺羰基还原酶）或对保守的酪氨酸的羟基。Ser残基最有可能是作用于底物，稳定的反应中间体，和产品通过氢键结合。这个概念是由Oppermann 等人研究的。其中CT菌中苏氨酸3ß/ 17ß-HSD产生相同的催化常数活性蛋白替代Ser 138。然而，一些SDR的蛋白质，像CT菌 中3a-HSD/CR研究，大鼠二氢蝶啶还原酶，肺炎克雷伯杆菌核糖醇脱氢酶，既不含丝氨酸也不含苏氨酸，而是在Ala或Val位置。这让我们，在第一个实例，推测改进反应机制参与CT菌中3a-HSD/CR催化。

在最近的研究中，3a-HSD/CR以及与NAD +的二维结构复杂的晶体结构已被解决，分别在1.68和1.95分辨率。晶体结构揭示了一个同型二聚体的不对称单位代表生理活性。虽然3a-HSD/CR单体亚基显示了一个典型的SDR结构，其拓扑结构的一些细节不同于这个蛋白家族其他成员。SDR蛋白的特殊结构模体是由核苷酸结合或由Rossmann折叠形成的中心六股平行的β-折叠片在两组a-螺旋之间的βaβ。所有的SDR的这种折叠，C-末端的至少一个额外的α-螺旋（AG）和七分之一个平行的β连（BG）。显然，Rossmann折叠基序截断3a-HSD/CR，因为它缺乏螺旋aC，只有一个基本的βC螺旋左股。类似的这种结构元件存在于SDR的二氢蝶啶还原酶和GDP海藻糖合成酶的结构。另一方面，有一个28个氨基酸的插入在3a-HSD的Rossmann折叠模体βE链和a螺旋之间。这个插入，在任何其他已知结构的SDR不一致，在3α-HSD/ CR的低聚性质的重要意义。

4.2在SDR中的二聚化模式

3a-HSD/CR四维结构清楚地表明是二聚体由纯化的蛋白质凝胶过滤作用。到目前为止，SDR的所有结构表现出两个主要的亚组界面安排在非晶体的2倍轴，互相垂直，称为P和Q。P轴界面主要由aG螺旋和两个相邻亚组的βG连之间侧链主链的相互作用。q轴的界面主要由四个螺旋束组成的螺旋，aE和aF两个相互作用的亚基[ 34 ]。在所有的同型二聚体的SDR中，到目前为止，其结构已被确定，二聚体发生与SDR四聚体的Q轴界面相一致。然而，这种模式的二聚，在3a-HSD/CR空间是不可能的，因为28个氨基酸插入经典Rossmann折叠模体βE链和aF螺旋之间。这种插入，主要由α-螺旋的部分组成，掩盖了Rossmann折叠βE链和aF螺旋，从而防止四螺旋束的形成。因此，在3a-HSD/CR中二聚化的发生通过P轴界面。亚基接触通过主链和侧链的相互作用，以及由两根反向平行的aG螺旋包装。

4.3NAD+结合和催化中心

三残基，即在3a-HSD/CR中的ser114，tyr155和lys159，在SDR家族形成一个必不可少的催化和保守区域。在3a-HSD/CR这些氨基酸的排列几乎是相同的，通过其他已知结构的SDR，这个蛋白家族可能存在一个共同的反应机制。

同样，在二维复杂的NAD +的辅因子中，在β链的羧基末端是可以叠加存在于其他二维或三维SDR辅助因子。因此，都是是核糖环为2‘内切构象异构体。烟酰胺环结合在一个syn和腺嘌呤基反扭角到各自的核糖部分。正如预期的那样，对于催化三联的烟酰胺环的定位也是非常相似的。结构表明，3a-HSD/CR依赖NAD（H）和很难接受NADP（H）作为辅助因子。Asp32侧链羧酸酯，残留的酶特别是NAD高度保守，形成的氢键都是腺苷核糖2’和4’羟基。因此，一个潜在的磷酸基团的2’位置的腺苷部分，将创建不利的接触。此外，在所观察到的Ile33相邻的侧链构象会阻碍磷酸存在的空间原因。NAD（H）的偏好于NADP（H），它可以从结构推断，证明3α-HSD/CR的分解性质。

4.4基质结合环

在许多SDR酶的结构中，所谓的底物结合环由3a-HSD/CR中188-213残基组成，几乎在完全无序的情况下结合的辅因子和底物。结合二核苷酸辅因子后，这个环的一小部分，可能成为稳定，只有在结合的羟基和羰基基质它采用的定义，通常是螺旋构象。SDR的底物特异性，很大程度上是由这个环输送。

5、3a-HSD/CR基因的基因组

正如已经提到的，酶催化类固醇降解没有表达，但都是由各自的底物诱导。早期的研究中，它表明，3a和3β-羟类固醇脱氢被激素诱导，如睾酮和孕酮。然而，所涉及的调节过程的分子基础知之甚少。虽然有一些证据表明，许多类固醇激素信号在脊椎动物中，也存在于单细胞生物，是可疑的，如果细菌类固醇诱导机制对应于脊椎动物，其中甾体诱导物与相应的受体蛋白作为靶基因表达的转录调控。

编码3a-HSD/CR基因（HSDA）位于CT菌染色体DNA的一个5.257 kb的大肠杆菌上。△5-3-类固醇异构酶的正下游被发现。△5-3-类固醇异构酶有助于甾核的A环不饱和，这是一个芳构化，随后通过双加氧酶裂解。基因是类固醇调节调节子的一部分，运送一连串的基因参与类固醇降解酶的编码是可能的。此外，5.2 kb的片段，包含三个开放阅读框（ORF）。ORF 1位于hsdA上游155 bp，ORF 2位于△5-3-ketosteroid异构酶基因的下游，其次是下游ORF 3。ORF 1和ORF 2都是面向hsdA相反的方向。

HSDA转录起始位点在转录起始位点上游28 bp通过S1核酸酶保护试验和引物延伸。启动子区域的范围在hsdA上游93 bp的区域，点和缺失突变导致识别上游-35和−10启动子序列。

6.3a-HSD/CR基因规律

有趣的是，hsdA表达被发现在负控制下，由两个阻遏蛋白（REP1，2），在相同的EcoRI片段被确定为的ORF 2和ORF 4。双质粒转化和进一步的分析表明，阻遏蛋白抑制非诱导条件下和表达。阻遏物基因型在与hsdA相反的方向。而REP1位于hsdA下游， REP2与hsdA本身重叠。

REP1含有78个氨基酸，分子量为8.8 kDa的小蛋白。对蛋白质数据库中的序列比较发现，46.2%的核苷二磷酸激酶（RNK）调节剂，在大肠杆菌中一个以前未知的蛋白，可以恢复在铜绿假单胞菌藻酸盐产生的缺陷，参与二磷酸核苷激酶调控。虽然RNK和Rep1之间的关系目前尚不清楚，这两个蛋白参与基因表达的调控。

数据库搜索未能对Rep2功能说明。作为Rep2重叠HSDA，不可能产生只含有一个基因的质粒。迁移实验表明，Rep2绑定到一个hsdA启动子上游9 bp的10核苷酸序列。一个互补的10个核苷酸序列被发现在上游1633bp。

基于我们的发现，这是HSDA调控的初步模型。Rep2结合两10nt的DNA回文序列，位于935和2568。后者的序列在hsdA启动子上游9 bp。显然，结合序列需要密切的相互联系，从而形成一个1.6 kb的环结构。或许，Rep2作为防止细菌RNA聚合酶结合到hsdA启动子区。此外，Rep2能够结合睾酮，而睾酮Rep2复合物不能与DNA结合。

Rep2、REP1可以抑制3a-HSD/CR的表达，这种抑制作用可以通过睾酮逆消除（数据未显示）。然而，没有DNA结合活性被发现。一个计算机模型计算3a-HSD/CR mRNA显示一个环结构在其5’末端REP1蛋白可以绑定。作为一个工作模型，我们建议REP1作为翻译抑制因子，可能通过结合3a-HSD/CR mRNA。

建议在适当的诱导剂的存在下，这些结合到阻遏蛋白，从而改变其构象和降低DNA（REP2）或3a-HSD/CR mRNA序列（REP1）顺式调控操纵子的亲和力。在游离Rep2，聚合酶结合到启动子和3a-HSD/CR mRNA的转录起始。同时，REP1从3a-HSD/CR mRNA的释放，从而使3a-HSD/CR翻译。因此，类固醇诱导CT菌中3a-HSD/CR 表达的抑制，似乎是通过阻遏蛋白的结合调控DNA和mRNA的区域。

7、结论

CT菌中3a-HSD/CR已被确定为SDR家族新成员。根据其多能底物特异性激素和非甾体类羰基化合物结合，这表明3a-HSD/CR有助于CT菌抑制天然和合成的有毒物质的重要防御策略。酶作为一个二聚体是有功能的。3a-HSD/CR最显著的特征是插入Rossmann折叠的βE链和aF螺旋之间，预防q轴型低聚接口中存在所有其他已知结构的同源四聚体和二聚体SDR。这是诱人的推测，3a-HSD/CR的低聚模型可能是在SDR之间不同的插入造成的，可以驱动的亚基之间的协同性。这种酶不是组成性表达，而是由类固醇诱导的，如睾酮和孕酮。然而，从我们的数据，事实上，睾丸酮激素诱导CT菌中3a-HSD/CR的抑制，似乎是通过类固醇诱导阻止两个阻遏蛋白的结合。

http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0009279700003021