Co-IP（免疫共沉淀）实验对照设计及结果分析介绍

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Co-IP是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，可以确定在生理状态下细胞内相互作用的蛋白质。在蛋白复合物的研究中，不仅可以用于验证其存在，还可以发现新的蛋白符合物。

Co-IP的原理及操作

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。假如细胞内存在XY蛋白复合物，用X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也被沉淀下来。沉淀经多次洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸后离心收集上清，对上清进行免疫印迹（Western blot，WB）检测Y蛋白的存在，如果Y出现，则说明蛋白X与蛋白Y存在相互作用。

如果Co-IP实验的目的为验证两个已知蛋白之间的相互作用，则也可以分别给两个已知蛋白融合特定的标签，利用标签抗体实现蛋白的沉淀及沉淀复合物中目的蛋白的检测。例如，分别使蛋白X及蛋白Y融合HA、c-Myc标签，利用HA标签的特异性抗体沉淀HA-X融合蛋白，随后利用c-Myc标签的特异性抗体对沉淀下来的复合物进行c-Myc标签的检测，如果存在c-Myc标签，则说明蛋白X与蛋白Y存在相互作用。

Co-IP实验对照设置

为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是“假阳性”），在Co-IP的实验设计过程中，需要设置正确的对照。

假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+目的蛋白Y”，则可能出现的“假阳性”及对应需要设置的实验对照如下表所示：

上述为了避免出现“假阳性”的对照称为阴性对照，除此之外Co-IP实验还会设置一个阳性对照组（Input组），Input组为直接利用抗体X（抗体Y）对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中存在蛋白X（抗体Y）。

在某些Co-IP实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行蛋白X和蛋白Y的WB检测，该对照组称为output组。

利用内源性Co-IP实验为验证两个蛋白是否存在已知作用，如果最终的结果为阳性，则可以证明两个蛋白之间存在相互作用；但如果结果为阴性，无法证明两个蛋白之间不存在相互作用，也有可能是蛋白在细胞内表达量低等原因导致。因此在进行内源性Co-IP验证两个蛋白是否存在相互作用时，建议先做过表达Co-IP作为对照。（节选自http://www.detaibio.com/topics/co-ip-overview.html）

Co-IP抗体的选择

在进行Co-IP实验前，需要确认抗体可以用于Co-IP实验。在Co-IP实验中，抗体需要识别蛋白的构象表位，只能识别线性表位的抗体可能无法将靶蛋白沉淀出来，因此并不是所有的抗体都可以用于Co-IP实验。另外，用于IP靶蛋白的抗体与用于Weatern Blot检测目的蛋白的抗体最好是不同种属的，以避免抗体污染。（为什么最好是不同种属？）

Co-IP琼脂糖及磁珠的选择

琼脂糖与磁珠都可以作为Co-IP实验中的固定相将“抗体-靶蛋白-目的蛋白”复合物从细胞裂解液中分离出来。相较于琼脂糖，磁珠具有较高的易用性及较低的非特异性结合，是更加优质的选择。

Co-IP结果验证

目的蛋白为已知蛋白

目的蛋白为已知蛋白，Co-IP实验可以验证两个已知蛋白是否存在相互作用或者验证细胞中是否存在该目的蛋白。制备或得到已知蛋白的特异性抗体，利用特异性抗体对IP得到的沉淀复合物进行

目的蛋白为未知蛋白

目的蛋白为未知蛋白，Co-IP的目的为在细胞裂解液中寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白。由于目的蛋白为未知蛋白，无法得到特异性抗体，因此无法进行WB检测实验。此时需要对IP得到的沉淀进行质谱分析，将质谱分析得到的结果进一步进行已知蛋白与已知蛋白的验证实验。

Co-IP与免疫沉淀（IP）实验的区别

免疫沉淀

免疫沉淀是用于抗原检测和纯化的最广泛使用的方法之一。免疫沉淀（IP）的原理为：针对特定靶蛋白的抗体与样品（细胞裂解物等）中的靶蛋白形成免疫复合物，随后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来。最后将靶蛋白从磁珠上洗脱（如果抗体没有共价连接到磁珠上或使用变性缓冲液进行洗脱，抗体也会被洗脱下来），并通过SDS-PAGE，Western Blot等手段对洗脱下来的蛋白进行分析。

Co-IP

Co-IP是免疫沉淀的延伸，主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。Co-IP的原理是基于IP反应捕获和纯化靶蛋白，如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白，也会被一同捕获及纯化得到，随后利用SDS-PAGE，Western Blot等手段对得到的目标蛋白进行分析（查看详细Co-IP实验原理）。

通常，判断一个实验是IP实验还是Co-IP实验，只需判断实验的研究重点是靶蛋白（IP沉淀下来的蛋白）还是目标蛋白（相互作用蛋白）。