降落PCR( touchdown PCR, TD PCR)详细介绍

一、引言 从复杂的DNA模板通过PCR扩增基因,要受到许多参数的影响。PCR反应的最好结果就是在凝胶电泳中只观察到目的产物的单一条带,但是,较弱的带、多条带、甚至没有带的情况也经常出现。许多参数的变化能影响PCR扩增的结果,这些参数包括循环次数、Mg2+、H+、dNTP、引物和模板。每个PCR反应对每个参数都有一个最适值,通常这个值要由经验来决定对大多数参数来说,从一个方向改变数值有利于特异性提高,当接近于最适值时,则特异产物产量减少;从相反的方向改变参数值,有利于增加产量,但是特异性降低。一般而言,选择合适的PCR参数要花费大量时间、精力。降落PCR( touchdown PCR, TD PCR)代表了一种完全不同的PCR优化方法,并不去尝试改变缓冲液、循环条件等,优化只集中在一个参数—退火温度上,并且在一个程序中,可采取一系列不同的退火温度。 二、原理 降落PCR是Dn于1991年最早发明的,指每一个(或n个)循环降低1(或nC)退火温度,直至达到一个较低的退火温度,这个温度称为“ touchdown”退火温度,然后以此退火温度进行10个左右的循环。据统计,正确和非正确退火温度之间的1差异将造成FR产物量的4倍差异,如果相差5,就会产生42(1024)倍的优势,因此相对于非正确产物,正确的产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的T值的15左右,在接下来的循环中,退火温度以每次12逐渐降低,直到T值以下5,当达到特异的引物模板结合的T值时,扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时,特异产物会有一个几何级数的起始优势,在剩余反应中,特异产物优先扩增,从而产生单一的占主导地位的扩增产物。这种方法主要用于避免非特异PCR产物的出现,尤其是当使用复杂的基因组DNA模板,非特异的退火更容易发生时。 降落PCR中正确的产物得到富集,原理在于温度的升高提高了PCR扩增的特异性,但也提高了引物结合的难度,降低了扩增的效率,因此一开始先用高温扩增,保证扩增的严紧性,待目的基因的丰度上升后,降低扩增的温度,提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低,无法和特异位点竞争)。但是,降落PCR无法改善扩增效率低的问题,一般用于在杂模板中提高扩增特异性。 三、材料 10×PCR缓冲液:15mmol/ L MgCI,500mmoM/LKCl,1mml/ L Tris-CI,0.1%(体积分数) Triton X10 dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为25mmol/L。 正、反向特异引物:两者的引物均为10 umol/L 模板:可以是cDNA、基因组DNA或其它DNA Taq DNA聚合酶。 高压灭菌去离子水。 用于琼脂糖凝胶电泳的试剂 PCR扩增仪:具有降落PCR程序,如 PE Genamp PCR System2400 四、方法 1.引物 根据所需扩增片段,设计两条特异引物,设计引物的原理同常规PCR,引物的贮存浓度通常为10pmol/L 2.模板 可以是CDNA、基因组DNA或其它DNA。 3.操作方法 (1)设立50l的PCR反应体系在0.25ml的PCR管中,分别加入: 10×PCR缓冲液 lDNA模板 5(100ng) 2.5mmo/L的dNTP混合液 lul Taq DNA聚合酶(5U/pl) 0.5l 10mol/L的外引物(Pl、P2)各1lH2O 如果PCR仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约50l)。将PCR试管放入到PCR仪上 2)设置PCR反应条件常规PCR方法一般是25~35个循环,降落PCR一般要比它多5~10个循环,为35~40个循环,因为降落PCR程序开始的温度高于最适退火温度(未知),在降落PCR程序中,有效的扩增直到运行几个循环(不确定)后才开始,为了补偿,降落PCR要比常规PCR多运行几个循环。下面给出一个降落PCR的程序: 94预变性3min; 2.4变性30s,65退火30s,72延伸1min(目的片段为1kb) 以后每个循环退火温度降低1,共20个循环—退火温度从65降落到45; 94变性30s,45退火305,72延伸1min,15~20个循环 72延伸10mn; 4保存。 PCR反应中的延伸时间要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成1000bp左右 (3)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳反应结束后,用10μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析,一般来说琼脂糖浓度为1%,缓冲液为1×TAE。若试验成功,应出现一条目的带,至少目的带的亮度与其它非特异扩增带相比,差异显著。 五、降落PCR与常规PCR的比较 降落PCR与常规PCR相比,只是退火温度设置的不同,因此在操作时的注意事项与常规PCR相同。下面介绍一些关于降落PCR与常规PCR的结果比较,以及关于降落PCR的一些简便方法,从中对降落PCR可有一个更为全面

Hecker等的实验比较了不同退火温度的常规PCR与降落PCR的差异。他们扩增了403bp和187bp的两个片段(图12-3),使用常规PCR方法的退火温度分别为40、45、50、55、60、65,降落PCR从60降落到46,每两个循环降低1,然后再加50退火10个循环。为了比较,循环数都采用40个循环。结果,对于常规PCR在合适的退火温度,都出现了单一的特异条带。在较高的退火温度时,特异性增加,但产物的产量下降,温度更高时,便没有产物出现(65)。在较低的退火温度时,由于假阳性产物的竞争,特异产物量下降,最终无法检测出(40)。而用降落PCR时,出现了一条很强的带,表明尽管降落PCR的40个循环中有30个循环是在5以下的退火温度运行的(在这些温度,常规PCR中会产生大量的非特异引发,导致假阳性产物的出现),但仅有特异产物出现,明显地证明了降落PCR的优点 降落PCR,即在退火温度分别下降5、10、15之后,接着再加上固定退火温度的足够的循环数,可以发现在Tm值之下退火温度循环的作用(图12-4)。最后的固定退火温度可以是60(有利于特异性提高),也可以是50(容易引起非特异引发)。在三种截断型降落PCR(6560、65→5、65→-50)中,反应条件为每个循环降低0.5,后面跟着50和60的两种固定退火温度,每个反应的总循环数为35个。在403bp的扩增产物面跟着50和60的两种固定退火温度,每个反应的总循环数为35个。在403bp的扩增产物产量。与标准常规PCR相比,在降落PCR中,如果前面10个循环在有利于特异引发的条件下即使后面的25个循环温度较低,也不会产生非特异带,因为此时特异带的数量已占优势。但在187bp的扩增产物中没有发现产量上的区别,可能在这个反应中引物与模板容易结合,在循环的早期就达到了最大产量

Hecker等人的实验还证明了在缓冲液条件不是最佳时,降落PCR也会弥补反应的效率

对于许多PCR仪,降落PCR的一个缺点是在设定退火温度时,程序较为复杂。为了解决这个问题, Hecker等人试用了称为“ stepdown”PCR(SDPR)的方法,它是降落PCR的一种修改方式,在一个程序内的最高和最低退火温度之间采用较少的更为剧烈的变化方式。例如,退火温度从69降到55,差距为15,中间分为5步,每3个循环降3,然后再加5的20个循环。另外一种为两步PCR,前10个循环为较高的温度(如70),后加55的35个循环125)。电泳结果表明,第一种“ stepdown”PCR与降落PCR一样,得到很好的结果,而两步PCR法也得到了很清晰的目的带,但出现了一些非特异产物;退火温度为55的常规PCR,出现了目的带,但同时污染了较多的非特异产物;退火温度为70的常规PCR没有出现任何带。两步PCR法比常规PCR结果要好,可能是在高于经验决定的T值时,大量的特异引发有助于单一产物的产生。这也说明了降落PCR早期的高温循环对于扩增产物的特异性有所帮助 六、应用 降落PCR有着很广泛的应用,主要用于增加PCR的特异性和敏感性。例如在临床诊断方面,引起间质性浆细胞肺炎( pneumocystis carnal pneumonia)的卡氏肺孢子虫的检测,传统的检测方法是组织的显微镜检测,费时,而且敏感度不够,现在有很多研究者使用PCR的方法进行检测,他们把降落PCR与定量PCR结合起来,检测样品中的病原数量,敏感性好,精确度也高,在 Larsen HI等人的研究中,当他们使用退火温度为50的常规PCR程序时,得到的结果不尽如人意。后来改用了降落PCR的方法,退火温度由65降到50(2~6个循环,每个循环降低1;7~11个循环,每个循环降低2),然后在退火温度为50时35个循环。结果表明,使用降落PCR时,12个样品全部检测为阳性;而同样条件下,使用常规PCR程序,12个样品中只有7份是阳性 在 Seo ml等的工作中,他们试图设计一对引物去同时检测兰科植物中感染很广的两种w#, cymbidium mosaic potexvirus( CymMV) Fl odontoglossum ringspot tobamovirus (ORSV)预计扩增PCR的片段分别是534bp( CymMV)和290bp(ORSV),当使用标准PCR程序扩增时,退火温度为55,但是 CymMV的534bp片段的扩增效率远远高于ORSV的290bp片段,290bp片段几乎看不见,可能是 CymMV的这段序列(G+C)含量较高,有较高的退火结合温度。后来他们尝试了降落PCR的方法,起始温度分别为50、48、46,每个循环降低0.5,共30个循环。结果表明当起始退火温度为48时,电泳检测两条带的强度相似,产物比起标准PCR程序都有所增加。说明降低起始退火温度,更有利于引物与ORSv结合。但当降落PCR的起始退火温度降到46时,就出现了较多的非特异产物。因此,最后他们选择了起始退火温度为48的降落PCR 降落PCR的另一个应用是在确定已知氨基酸序列肽的DNA序列。具体过程如下:使用两条与已知序列肽两末端可能配对的简并引物,需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列,5和3′引物各长18个碱基(6个氨基酸),两者之间有一个碱基或更长的间隔,进行“ touchdownPCR”。由这种方法将获得大量的产物,但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离,所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。如果克隆和测序几个PCR产物,将可以确定肽的正确编码DNA序列,可用于设计进行杂交的寡核苷酸。该技术特别适用于由Ser,Iys和Arg(每个有6个密码子)构成的多肽 七、小结 降落PCR的出现对于解决PCR过程中出现的非特异性的问题提供了一个很好的解决方法,与常规PCR方法相比,它能够增加特异性及目的产物的产量。它的主要特点有:第一,低水平高特异性的扩增在循环的早期开始,此时的退火温度高于“最适合”的退火温度;第二,当退火温度在目的产物的Tn值与假阳性产物的T值之间时,目的产物的竞争优势更加明显;第三较低的退火温度能很有效地增加目的产物的产量,同时使非特异的扩增降到最低,因为特异序列在较高退火温度时得到扩增,等退火温度降到较低时,已积累大量的特异产物,减少了特异引物与非特异序列结合的机会。降落PCR虽然有一定的优势,但它并非万能,在PCR中出现的问题,应具体问题,具体解决。现在很多的PCR仪具有设置降落PCR的程序,降落PCR在研究领域中已得到了广泛的应用。根据各种不同工作的需要,还可与其它PCR方法同时使用,如实时定量降落PCR(real- time quantitative touchdown PCR)6、竞争降落PCR( competitivetouchdown PCR)等,这些联合PCR的反应体系,所需材料均与实时定量PCR和竞争定量PCR相同,所不同的是在PCR的循环过程中使用退火温度渐低的降落PCR的方法,检测PCR产物的方法与硬件也均同于实时定量PCR和竞争定量PCR