外显子组测序（Exome Sequencing）-派森诺生物
派森诺生物www.personalbio.cn始终以“解析序列，诠释生命”作为企业理念，秉承“立足客户需要，满足个性需求”的服务宗旨，专业提供动植物基因组测序、微生物基因组测序、宏基因组测序、RNA测序、简化基因组及外显子捕获等技术服务。
外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，该区域包含着合成蛋白质所需要的信息，涵盖了与个体表型相关的大部分的功能性变异。外显子组测序是以高效捕获为前提，相对于全基因组测序，外显子组测序的覆盖度更深，数据准确性更高。同时基于大量的公共数据库提供的外显子数据，能够结合现有的资源更好地解释研究成果。
一、 技术路线
推荐平台：Illumina HiSeq 2000
二、生物信息分析
1. 原始数据整理、过滤及质量评估
2. 捕获外显子分析
捕获外显子在基因组上的定位
捕获基因的功能注释
SNPs位点鉴定
SNPs位点的确认（SNP 与 dbSNP 比较）
同义/非同义突变基因的鉴定
3. 根据客户需求进行个性化分析
三、样品要求
1. 基因组DNA：浓度≥100 ng/μl，总量≥50 μg，OD 260/280介于1.8-2.0之间，电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整。样品浓度越高越好。
2. 血液样品：请使用专业抗凝管储存样品。
3. 样品中有多糖、糖蛋白的残留，往往对打断DNA样品带来非常大的麻烦，且很难去除，因此特别要求，客户提供的样品一定要将多糖或糖蛋白去除干净。
4. 样品保存期间切忌反复冻融。
四、经典案例
案例1：运用外显子测序对卵巢透明癌诊断治疗
背景：卵巢透明细胞癌（Ovarian clear cell carcinoma，OCCC）是一种基本上耐受治疗的人体侵袭性癌症。
目的：对癌细胞进行免疫亲和纯化后对8个肿瘤的外显子组进行测序，探究OCCC的遗传起源，鉴定相关的突变基因。
结果：平均84×的覆盖深度，在至少2个肿瘤中鉴定出4个突变基因，其中PIK3CA和KRAS基因之前被证实与OCCC有关，还有2个新的基因PPP2R1A和ARID1A。在共42例OCCC的后续验证后，发现7%存在PPP2R1A突变，57%存在ARID1A突变。说明了肿瘤外显子组测序的极大价值。
[ Jones S, Wang TL, Shih IM, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma. Science, 330(6001): 228-231 ]
案例2：前列腺癌中常见突变检测
背景：前列腺癌的发病率呈上升趋势，但目前的检测方法还主要是病发后的切片检测，不利于疾病的提前治疗。
目的：利用Roche 454高通量测序平台对112对前列腺癌患者和正常人的样本进行外显子组测序，希望发现相关的变异序列。
结果：研究表明在多种基因中均存在新的高丰度突变，包括MED12，FOXA1和SPOP。在6%-15%的肿瘤中都发现SPOP的靶基因存在突变，从而证明外显子测序能成为前列腺癌分子检测的一种极具发展潜力的新模式。
[ Christopher EB, Sylvan B, Sylvan CB, et al. Exome sequencing identifies recurrent SPOP, FOXA1 and MED12 mutations in prostate cancer. Nature Genetics, 2012, 44: 685–689 ]
五、常见问题解答
1. Q：外显子组测序需要多少的覆盖深度？
A：我们推荐采用100×的覆盖深度，但具体将根据项目的具体需求选择合适的覆盖深度。
2. Q：相对于芯片检测，外显子组测序有何优势？
A：相对于芯片检测，外显子组测序可以检测未知序列，考虑到引物的Tm值，芯片只能检测具有同一性的片段，并且无法检测低拷贝的序列，且背景噪音较大。相对于基因组测序，外显子组测序目标明确，数据量小，更加经济、高效。
3. Q：目前市场上主要有哪些人外显子捕获试剂盒？
A：目前市场上外显子组捕获平台包括：Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit，Roche NimbleGen Sequence Capture Human Whole Exome 2.1M Array、Roche NimbleGen Sequence Capture EZ 和Agilent SureSelect Human All Exon Kit等，我们公司主要采用Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit进行外显子组测序。
4. Q：目前市场上比较成熟的外显子捕获试剂盒是主要针对哪些物种？
A：目前市场上已有的成熟的外显子捕获试剂盒主要是针对人和小鼠，而其他的有参考基因组的物种进行外显子组测序则需要根据物种基因组的具体信息专门定制相关的试剂。
外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，该区域包含着合成蛋白质所需要的信息，涵盖了与个体表型相关的大部分的功能性变异。外显子组测序是以高效捕获为前提，相对于全基因组测序，外显子组测序的覆盖度更深，数据准确性更高。同时基于大量的公共数据库提供的外显子数据，能够结合现有的资源更好地解释研究成果。
一、 技术路线
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推荐平台：Illumina HiSeq 2000
二、生物信息分析
1. 原始数据整理、过滤及质量评估
2. 捕获外显子分析
捕获外显子在基因组上的定位
捕获基因的功能注释
SNPs位点鉴定
SNPs位点的确认（SNP 与 dbSNP 比较）
同义/非同义突变基因的鉴定
3. 根据客户需求进行个性化分析
三、样品要求
1. 基因组DNA：浓度≥100 ng/μl，总量≥50 μg，OD 260/280介于1.8-2.0之间，电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整。样品浓度越高越好。
2. 血液样品：请使用专业抗凝管储存样品。
3. 样品中有多糖、糖蛋白的残留，往往对打断DNA样品带来非常大的麻烦，且很难去除，因此特别要求，客户提供的样品一定要将多糖或糖蛋白去除干净。
4. 样品保存期间切忌反复冻融。
四、经典案例
案例1：运用外显子测序对卵巢透明癌诊断治疗
背景：卵巢透明细胞癌（Ovarian clear cell carcinoma，OCCC）是一种基本上耐受治疗的人体侵袭性癌症。
目的：对癌细胞进行免疫亲和纯化后对8个肿瘤的外显子组进行测序，探究OCCC的遗传起源，鉴定相关的突变基因。
结果：平均84×的覆盖深度，在至少2个肿瘤中鉴定出4个突变基因，其中PIK3CA和KRAS基因之前被证实与OCCC有关，还有2个新的基因PPP2R1A和ARID1A。在共42例OCCC的后续验证后，发现7%存在PPP2R1A突变，57%存在ARID1A突变。说明了肿瘤外显子组测序的极大价值。
[ Jones S, Wang TL, Shih IM, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma. Science, 330(6001): 228-231 ]
案例2：前列腺癌中常见突变检测
背景：前列腺癌的发病率呈上升趋势，但目前的检测方法还主要是病发后的切片检测，不利于疾病的提前治疗。
目的：利用Roche 454高通量测序平台对112对前列腺癌患者和正常人的样本进行外显子组测序，希望发现相关的变异序列。
结果：研究表明在多种基因中均存在新的高丰度突变，包括MED12，FOXA1和SPOP。在6%-15%的肿瘤中都发现SPOP的靶基因存在突变，从而证明外显子测序能成为前列腺癌分子检测的一种极具发展潜力的新模式。
[ Christopher EB, Sylvan B, Sylvan CB, et al. Exome sequencing identifies recurrent SPOP, FOXA1 and MED12 mutations in prostate cancer. Nature Genetics, 2012, 44: 685–689 ]
五、常见问题解答
1. Q：外显子组测序需要多少的覆盖深度？
A：我们推荐采用100×的覆盖深度，但具体将根据项目的具体需求选择合适的覆盖深度。
2. Q：相对于芯片检测，外显子组测序有何优势？
A：相对于芯片检测，外显子组测序可以检测未知序列，考虑到引物的Tm值，芯片只能检测具有同一性的片段，并且无法检测低拷贝的序列，且背景噪音较大。相对于基因组测序，外显子组测序目标明确，数据量小，更加经济、高效。
3. Q：目前市场上主要有哪些人外显子捕获试剂盒？
A：目前市场上外显子组捕获平台包括：Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit，Roche NimbleGen Sequence Capture Human Whole Exome 2.1M Array、Roche NimbleGen Sequence Capture EZ 和Agilent SureSelect Human All Exon Kit等，我们公司主要采用Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit进行外显子组测序。
4. Q：目前市场上比较成熟的外显子捕获试剂盒是主要针对哪些物种？
A：目前市场上已有的成熟的外显子捕获试剂盒主要是针对人和小鼠，而其他的有参考基因组的物种进行外显子组测序则需要根据物种基因组的具体信息专门定制相关的试剂。
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