5+单细胞+分型+预后模型+空转+简单实验，T细胞发文方向，可借鉴

导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Regulatory T cells are associated with the tumor immune microenvironment and immunotherapy response in triple-negative breast cancer.”，这篇文章发表在Front Immunol期刊上，影响因子为5.7。

结果：

从 GSE21中提取 125449 个样本的 scRNA-seq 数据并重新分析。在这些样本中，13 例来自正常乳腺组织，2 例来自 TNBC。作者使用经典标志物定义了六个细胞簇：B_plasma细胞、髓细胞、NK_T细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞（图 2A）。为了探索 NK_T 细胞的异质性，作者提取了定义为 “NK_T 细胞 ”的细胞并重新聚类数据。此外，这些 NK_T 细胞根据已知的细胞标志物聚集为五个主要群体，包括初始 T、调节性 T （Treg）、循环 T、细胞毒性 T 和 NK 细胞（图 2B）。由于 Treg 细胞有利于形成肿瘤抑制微环境，从而促进肿瘤进展并降低对免疫治疗的反应，因此作者探索了肿瘤形成过程中 Treg 细胞浸润的变化。有趣的是，与正常乳腺组织相比，作者观察到 Tregs 浸润到 TNBC 组织中的程度显着增加（图 2C-D）。

为了鉴定与 Tregs 浸润相关的关键标记基因，使用 CIBERSORT 算法对 Treg 浸润进行定量，并使用 WGCNA 检测与 Treg 浸润相关的基因模块。为了构建一个无标度的 WGCNA 网络，作者选择了 β = 5 的软阈值幂。在 METABRIC 队列中鉴定出 0 个基因模块，其中蓝色基因模块与 Treg 浸润呈正相关 （r = 29.5，P = 07e-0），与患者生存状态呈负相关 （r = 12.0，P = 03.3） （图 3A）。作者进一步研究了 Treg 细胞模块成员身份与基因意义之间的相关性，结果表明蓝色模块与 Treg 细胞浸润高度相关。使用 METABRIC 队列中可用的生存数据和蓝色模块基因的表达值，作者使用单变量 Cox 比例风险模型进行了生存分析，并确定了 22 个与 Treg 浸润相关的预后基因。然后，作者根据这 298 个基因的表达值对 METABRIC 队列中的患者进行无监督聚类。METABRIC 队列中共有 174 名患者被分为两组：Cluster1 中有 124 名患者和 Cluster2 中有 3 名患者（图 3B）。PCA 还显示两组是不同的（图 3C）。热图（图 3D）还显示这些基因的表达模式在 Cluster2 和 Cluster2 之间有所不同。此外，卡方检验表明，与 Cluster1 患者相比，Cluster3 患者表现出更高的肿瘤分级、分期和更差的生存状态（图 3E）。生存分析还显示，Cluster1 组的 Predicting 比 Cluster3 组差（图 3F）。考虑到 TNBC 患者可对多种化疗药物产生耐药性，作者评估了这两组对四种 TNBC 化疗药物的反应：吉西他滨、多柔比星、吉非替尼和顺铂。作者在 GDSC 细胞系数据集上使用岭回归训练预测模型，并使用 50 倍交叉验证对其进行评估，以获得令人满意的预测准确性。作者根据这四种化疗药物的预测模型估计了 METABRIC 数据集中每个样本的 IC1。结果显示，Cluster3 患者对这四种常见的化疗更敏感（图 3G）。作者还使用 METABRIC 数据库调查了不同集群中患者之间拷贝数变异 （CNV） 变化的差异。与 Cluster2 相比，Cluster2 预后较差，各种促瘤基因位点（如 E3F3、MYC 和 GATA1）的染色体扩增，以及肿瘤抑制基因 PTEN 和 RB3 位点所在染色体的部分或完全缺失。

为了促进 Treg 浸润相关基因在预后中的临床应用，作者采用了两种机器学习算法来筛选所有 22 个 Treg 浸润相关基因的关键基因。LASSO 和随机森林分别鉴定了 13 个和 4 个关键基因 。然后，选择两种算法的 4 个交叉基因，包括 TK2、亚精胺合酶 （SRM）、PSMD3、NFE5L1、LOX、KDM1B 和 RBPJ 相互作用和微管蛋白相关 4 （RITA5），构建多变量 Cox 回归模型（图 4A-B）。研究了每个模型基因之间的相关性。使用 Kaplan-Meier 生存分析探讨了它们各自对 OS 时间的影响。应用 Wilcoxon 检验来探索它们在训练队列中正常组织和 TNBC 组织之间的表达水平。所有模型基因的表达差异显著，其中 KDM4B 、 LOX 、 SRM 和 TK5 与预后显著相关。然后根据中位风险评分将 METABRIC 队列中的患者分为两组，Treg 浸润相关风险评分较高的患者 OS 较差（图 4C）。此外，时间 ROC 曲线显示，风险评分对 7 年内患者 OS 具有良好的预测性能，AUC 约为 4.58812（图 4F）。为了验证风险评分的预后意义，作者使用相同的公式在两个队列 （GSE3 和 SCAN-B） 中获得 Treg 浸润相关风险评分。风险评分在这两个验证队列中具有相似的预后价值，并且对 OS 具有良好的预测性能（图 4D、E、 G、H）。此外，多变量 Cox 分析表明，Treg 浸润相关风险评分可用作 TNBC 的独立预后因素。

为了揭示每个风险评分组的通路激活差异，作者根据 KEGG 通路基因集计算了 GSVA 评分。如图 5A 所示，高风险评分的患者对代谢相关通路的激活程度较高，例如脂质和氨基酸代谢相关通路，这与报道的 Treg 细胞代谢特性一致。然而，高风险评分的患者显示免疫相关通路的激活较低，例如 T 细胞和 B 细胞受体信号通路（图 5A）。此外，METABRIC 队列和 SCAN-B 的 CIBERSORT 算法结果显示，相对于低风险评分患者，高风险评分患者的 B 细胞和 CD8 T 细胞浸润较低，但 Treg 细胞和 M2 巨噬细胞浸润较高（图 5B  ）。有趣的是，高危组的肿瘤突变负荷 （TMB） 水平低于低风险组（图 5C）。此外，作者确定了低风险评分组和高风险评分组之间免疫检查点表达的差异，显示高风险评分患者免疫检查点基因的表达低于低风险评分的患者（图 5D）。最后，作者计算了风险评分基因与免疫细胞浸润之间的相关性。结果显示，大多数基因与促进免疫治疗反应的免疫细胞浸润（B 细胞、CD8 T 细胞）呈负相关，与 Treg 细胞浸润呈正相关（图 5E）。

上述结果表明，Treg 浸润相关风险评分与免疫治疗效果相关。作者收集了一个包含 TNBC 患者免疫治疗数据的数据集，GSE173839。箱形图显示免疫治疗无反应者的风险评分高于免疫治疗反应者（P = 0.023， 图 6A）。高危评分组对免疫治疗无反应的患者百分比高于低风险评分组 （图 6B）。此外，ROC 曲线分析表明，Treg 浸润相关风险评分在预测免疫治疗反应性方面表现优异 （AUC = 0.796， 图 6C）。作者采用两种不同的方法来识别 Treg 浸润相关风险评分高的患者具有较高药物敏感性的候选药物。使用 CTRP 和 PRISM 衍生的药物反应数据进行分析。首先，在高 Treg 浸润相关风险评分组和低 Treg 浸润相关风险评分组之间进行差异药物反应分析，以确定高 Treg 浸润相关风险评分组中估计 AUC 值较低的化合物 （log2FC > 0.10）。接下来，作者使用 AUC 值与 Treg 浸润相关风险评分之间的 Spearman 相关系数来选择具有负相关系数的化合物。这些分析产生了 523 种 CTRP 衍生化合物（包括 SGX-6482、DNMDP、tivozanib、AZD04800985、BRD-K4720、PLX-0752、MK-1、MI-33199242、BRD-K100 和 TG-115-6）（图 6D ）和 87 种 PRISM 衍生化合物（包括 uprosertib、NVP-BEZ2243、BAY-6-6 和 temsirolimus）（图 6E ）。所有这些化合物在高 Treg 浸润相关风险评分组中的估计 AUC 值较低，并且与 Treg 浸润相关风险评分呈负相关（图 6D d、 E b）。

为了提高上述风险评分的预测能力，将风险评分和肿瘤大小相结合，使用多变量 Cox 回归分析建立列线图模型（图 7A）。1 、 2 、 3 和 5 年的疾病特异性生存 （DSS） 校准曲线显示，预测的生存概率与实际生存率一致，证明了该列线图在预测生存方面的稳健性（图 7A）。此外，还进行了 DCA，结果表明列线图的预后价值优于单个变量的预后值（图 7A）。此外，作者的研究结果表明，列线图预测的 AUC 超过了训练集和测试队列中的风险评分（图 7B-E）。

空间转录组分析结果显示，TK1 阳性表达细胞主要位于肿瘤细胞中。此外，它表明 TK1 高表达的 TNBC 组织中 Treg 细胞浸润增加（图 8A-B）。采用 Treg 标志物-FOXP3 多重荧光染色法评估 31 例 TNBC 患者，检测 TK1 表达与 Tregs 的关系。正如预期的那样，TK1 表达与 Treg 标志物 Foxp3 的表达状态呈正相关（图 8C-E）。这一结果表明，TK1 表达较高的患者表现出更多的 Treg 浸润。

然后分析 TK1 与 TCGA 泛癌队列中 Hallmark 通路之间的关系。本研究的结果表明，在多种癌症类型中，TK1 与细胞周期和增殖相关途径呈正相关，例如 MYC 靶点和 MTORCI 信号通路（图 9A）。分析 TCGA 队列中 1 种癌症类型的肿瘤和正常组织中 TK20 的表达;TK1 在 70% 的肿瘤中上调，包括 BLCA、UCEC、HNSC、PRAD、KIRP、COAD、LUSC、KIRC、LIHC、BRCA、THCA、LUAD、CHOL、ESCA 和 STAD（图 9B）。作者分析了 TK1 与 33 种癌症患者生存预后的关系，结果显示，在 1 多种癌症中，高 TK10 表达与生存障碍相关（图 9C）。

为了验证 TK1 在风险评分中作为关键参与者以及 TNBC 中肿瘤促进子的作用，作者进行了多项功能实验来检测对照组和 siRNA 介导的敲低组的迁移、侵袭和增殖能力。HPA 数据库显示 TK1 在癌组织中高表达（图 10A）。为了探讨 TK1 在体外 TNBC 增殖和迁移中的作用，使用靶向 TK1 的瞬时转染来抑制其表达 （si-TK1-1 和 si-TK1-2）。siRNA 介导的敲低降低了 MDA-MB-1 和 BT-231 细胞中 TK549 的表达（图 10B）。TK1 敲低后 TNBC 细胞的迁移、侵袭和增殖能力下降，差异有统计学意义。与对照组相比，CCK-8 （ 图 10D ） 和集落形成测定 （ 图 10E ） 的结果显示，沉默 TK1 分别显著降低了 TNBC 细胞的活力和增殖能力。此外，伤口愈合试验和 transwell 试验的结果还显示，与对照组相比，TK1 敲低后细胞的迁移能力降低（图 10C-F）。总之，这些发现共同证实了 TK1 促进 TNBC 细胞的增殖和迁移。

总结

在这项研究中，作者证明了 TNBC 中的 Treg 浸润相关基因可用于建立临床相关的 TNBC 分类。基于三个 TNBC 队列，作者开发并验证了 Treg 浸润相关预后模型，确定了 Treg 浸润相关基因在肿瘤免疫微环境发展和免疫治疗反应中的作用。此外，作者揭示了 Tregs 可能通过调节 TME 内 TK1 的表达来影响肿瘤的发生、进展和预后。作者确定了与 Treg 浸润相关风险评分呈负相关且药物敏感性较高的候选药物，可以预测 TNBC 临床结局和免疫治疗反应。作者相信，作者的 Treg 浸润相关预后模型可以拓宽作者对 TNBC 生物学和预后预测的理解，靶向 Tregs 为 TNBC 提供了一种有前途的治疗方法。