Advanced Materials|扩展嵌入式3D生物打印功能，利用自由形式血管网络工程复杂器官
前言
在体外按需创造功能性的组织和器官是增材制造的一个主要目标，但是复制组织和特定器官的外部几何形状和内部结构，例如血管，仍是研究最大障碍之一。近日，一篇名为“Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks”的文章由清华大学的孙伟教授和熊卓教授团队，发表在ADVANCED MATERIALS（IF=32.086）上。该研究开发一种可推广的在可逆墨水中顺序打印的生物打印策略（SPTRIT），利用一种基于微凝胶的双相生物墨水作为悬浮介质，利用SPIRIT策略可以有效打印具有可灌注血管网络的心室模型。结果证明SPIRIT技术可以更快的打印复杂的器官几何形状和内部结构，此技术将加速组织和器官的生物制造和在治疗上的应用。
背景介绍
在构建复杂的自由形式结构方面，嵌入式3D打印技术拥有很高的优势。在这种方法中，是将载有细胞的生物墨水打印到可牺牲的悬浮介质中，悬浮介质用于支持交联前的生物墨水在3D空间中的沉积，由于其独特的剪切变稀和自愈特性，悬浮介质在屈服应力下快速流化，在没有应力的情况下凝固。这种技术称为FRESH技术。另一种构建血管高仿生度的血管网络技术是以任意方式将牺牲生物墨水打印到载有细胞的悬浮介质中。这种技术称为SWIFT技术。但是以上两种方式均存在缺陷，本项目是开发一种在可逆墨水模版中顺序打印的技术，将两种技术结合，称之为SRIRIT技术。该技术包括以下几个阶段：
第一步：在可逆悬浮介质中打印生物墨水，以生成天然组织和器官的复杂外部几何结构。
第二步：将牺牲墨水打印到初次打印但未交联的结构中，生成自由形式的血管网络。
第三步：原位光交联保证打印结构的完整性，并去除悬浮介质和牺牲墨水。
实验过程与结果
1. 载有hiPSC细胞的MB生物墨水的制备和性能表征
本项目中，hiPSC封装在明胶/海藻酸钠水凝胶中，制备出微凝胶，粒径在200-230μm，通过清洗和离心去除多余液体，之后与GelMA水凝胶混合分别作为微凝胶相和水凝胶相。制备出基于微凝胶的生物墨水（MB），交联后，hiPSC活性为下降至45.8%±6.4%，剪切力对细胞活力有负面影响。HiPSC继续增殖，倾向于生常委细胞聚集体，也称胚状体（EB）。EB的直径随着培养时间增加而增加。培养8天后，通过免疫荧光检测和流式检测，证明在支架中，hiPSC维持多能性。在诱导分化为心肌细胞后，能观察到心肌细胞跳动，说明hiPSC成功分化为心肌细胞。
2. MB墨水嵌入式生物3D打印用于制备复杂结构
本研究测试了两种悬浮介质，一种是上普公司生产的悬浮胶，一种是用直径小雨7μm的明胶微粒基悬浮介质。这两种悬浮介质都具有剪切变稀性和自愈性。上普公司生产的悬浮胶具有光学成像优势和原位打印优势。明胶微粒基悬浮胶具有生物相容性和高温易去除的特点。后续实验主要用上普公司生产的悬浮胶。
通过测定打印参数中挤出量与丝径的关系，从而找到较合适的挤出量。通过在打印的碗中加墨水，和在支气管模型中灌墨水，从而确认MB墨水在悬浮介质中嵌入式打印后可以制备出结构完整度的模型，各个方向的细丝之间存在紧密的互连性。通过循环拉伸确定了MB嵌入式打印支架具有机械稳健性。嵌入式MB打印比普通的打印方式样品的弹性模量多2倍，这种差异的部分原因是嵌入式打印的样品没办法达到100%填充。
通过检测打印后HepG2细胞的死活染色和细胞活性，发现HepG2载入到MB墨水，并嵌入式打印后，细胞活性要比直接载入到gelma墨水中，活性要低。这可能是因为打印过程中的剪切应力造成的。
3. 用牺牲墨水在MB墨水悬浮介质中打印自由形式的血管
经过测试，打印机挤出速度和丝径呈现线性关系，打印血管时通过控制牺牲墨水打印的挤出量从而调整悬浮胶中孔径。将HUVEC细胞打印在支架中，可以观察到HUVEC均匀分布在整个模版化通道中，细胞增殖后，在通道中形成均匀、融合的内皮层。
4. SPTRIT打印原理和特点
MB生物墨水具有非常好的流变性，可以作为悬浮介质。
SPIRIT技术包括以下几个过程：
1）将MB生物墨水打印上普公司购买的悬浮胶或者明胶微粒悬浮介质中，以生成复杂的外部结构，例如腔室；
2）在第一次打印完成后，将牺牲墨水（F-127或者明胶）打印到初次打印但是未交联的MB墨水结构中；
3）通过原位光交联保证打印结构的完整性；
4）去除悬浮介质和牺牲墨水。
与目前的3D生物打印方法相比，SPIRIT技术有可能制备出外部几何形状和内部结构方面都非常复杂的组织和器官。下图中i图展示打印后，在管道中灌注蓝色墨水，可以看到液体的液体流动。并且自由形式的打印比以往的层层打印方式，打印时间更短。
5. SPIRIT技术打印带有自由形式血管网络的心室
心脏是一个空心的腔室器官，具有非常密集的血管网络，以满足其高氧气需求。本项目中创建了一个简化的心室模型，直径为2cm，壁厚为4mm，并在心室模型中间构建了分层的血管网络。试验中使用了上普悬浮胶作为可视化SPIRIT打印过程，用MB生物墨水先打印了心室结构，之后用明胶作为牺牲墨水，打印了血管网络。通过固定打印速度，改变挤出速率来调整每个分支的直径，成功嵌入了分层血管网络的心室结构。需要注意的是，血管网络打印顺序需要从下到上分配打印顺序，避免搅动或破坏MB生物墨水打印的图案，通过与注射泵连接反复灌注心室内的每个分层血管网络。
确保SPIRIT技术可以打印血管网络后，课题组又设计了一种更复杂可灌注的血管网络，可以密集填充心室模型。如图所示，实验室成功打印了一个具有3D曲折度和不同直径的致密血管网络，类似于冠状动脉血管树形态。活/死染色加过所示，打印血管网络在体外培养过程中极大地促进了打印组织的活力。免疫荧光染色正式了肌节的存在和细胞相互连接，表明打印心室的初步成熟。这些结果展示了打印组织的正常功能。
结论和展望
该研究中介绍了基于MB生物墨水的SPIRIT打印策略的概念，这种打印方式被证明MB生物墨水是非常适合作为嵌入式生物打印的悬浮介质。MB生物墨水可以通过负载hiPSCs，通过细胞增殖和分化，可以构建特定器官组织。例如可以用过打印一个具有自由形式血管网络的心室模型，提高氧气运输效率，从而提高细胞活力。这种打印方式可以推广到其他具有剪切变稀和自修复的水凝胶中，可以轻松构件嵌入式内部结构的复杂组织机构，并且打印时间大大缩短。可以加速生物制造用于组织工程和医疗上的应用。
参考文献
Yongcong F, Zhuo X, et al. Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks. Advanced Materials, 16 February 2023.