大鼠肝细胞培养技术，培养器材和培养基技巧不可缺！

肝细胞培养是研究肝细胞生物学和疾病发生机制的重要方法之一。在进行肝细胞培养之前，需要进行一系列的准备工作，包括获取大鼠肝细胞、准备培养器材和培养基等。本文将详细介绍这些准备工作的步骤和注意事项。

一、获取大鼠肝细胞获取大鼠肝细胞是进行肝细胞培养的第一步。一般情况下，我们采用胶原酶灌注法来分离大鼠肝细胞。具体步骤如下： 1. 首先，将大鼠用**麻醉，取出肝脏并放入离心管中。 2. 加入适量的DMEM低糖培养基，并用离心机离心10分钟，将上清液弃掉。 3. 用PBS洗涤肝脏，去除胆管和血管等。 4. 用1mg/mL的胶原酶A（Sigma C0130）溶液灌注肝脏，将肝脏放在37℃恒温摇床上振荡30分钟。 5. 滤过灌注液，得到肝细胞悬液。 6. 用完整DMEM高糖培养基冲洗肝脏悬液，并离心5分钟，将上清液弃掉。 7. 加入完整DMEM高糖培养基，调整细胞密度为1×106/mL。注意事项： 1. 需要使用无菌的器材和培养基，以保证细胞的纯度和生长状态。 2. 在灌注胶原酶之前，需要预热好含胶原酶的培养基，以保证灌注液的温度和浓度均匀。 3. 灌注液的pH值需要控制在7.4左右，过低或过高都会影响细胞的生长。 4. 振荡时间不宜过长，否则会影响细胞的活力。

二、准备培养器材进行肝细胞培养还需要准备一系列的器材，包括培养皿、离心管、试管、移液器等。这些器材需要经过严格的清洗和消毒处理，以保证无菌状态。 1. 清洗：将器材用去离子水清洗干净，去除污物和残留物。然后用70%乙醇浸泡至少30分钟，再用去离子水清洗干净。 2. 消毒：将器材放入自封袋中，用高压蒸汽灭菌器进行灭菌处理。处理时间和温度根据器材种类和大小而定，一般为121℃，15-20分钟。 3. 储存：消毒后的器材需要放在干燥、无菌的环境中储存，以免再次被污染。注意事项： 1. 器材的清洗和消毒必须严格按照操作规程进行，以保证无菌状态。 2. 不同种类的器材需要使用相应的清洗和消毒方法，不能混用。 3. 消毒后的器材需要使用无菌的手套和钳子取出，以避免再次被污染。三、准备培养基培养基是肝细胞培养的重要组成部分，需要选择适合肝细胞生长的培养基，并根据实验需要添加相应的生长因子和药物等。一般情况下，我们使用DMEM高糖培养基，添加10%的胎牛血清和1%的抗生素。具体步骤如下： 1. 取出DMEM高糖培养基和胎牛血清，放置于37℃恒温水浴中预热。 2. 加入1%的抗生素，如青霉素和链霉素等。 3. 搅拌均匀，过滤灭菌。

注意事项： 1. 培养基的配制需要按照操作规程进行，以保证培养基的成分和浓度准确无误。 2. 培养基的配制和保存需要在无菌条件下进行，避免被污染。 3. 不同的细胞类型需要选择适合其生长的培养基，不能通用。四、培养肝细胞在完成肝细胞的分离、器材的准备和培养基的配制后，可以进行肝细胞的培养。具体步骤如下： 1. 将分离得到的肝细胞悬液加入培养皿中，放入37℃恒温培养箱中培养。 2. 第一天不需要更换培养基，第二天更换一次培养基。 3. 每2-3天更换一次培养基，直到细胞密度达到80%左右。 4. 在细胞密度达到80%左右时，可以进行下一步实验。注意事项： 1. 培养皿和培养基需要在无菌条件下操作，以避免细胞被污染。 2. 更换培养基的时候需要小心，避免对细胞造成机械损伤。 3. 细胞密度过高或过低都会影响细胞的生长状态和实验结果，需要掌握好适宜的细胞密度。总结：以上是进行肝细胞培养前的准备工作的详细步骤和注意事项。进行肝细胞培养前，需要准备好无菌的器材和培养基，并按照操作规程进行清洗、消毒和储存。获取肝细胞的方法是采用胶原酶灌注法分离肝细胞。进行肝细胞的培养需要掌握好适宜的细胞密度和更换培养基的时机，避免对细胞造成损伤和影响实验结果。