A Mitochondrial RNA Processing Protein Mediates Plant Immunity to a Broad Spectrum of Pathogens

1. Title：A Mitochondrial RNA Processing Protein Mediates Plant Immunity to a Broad Spectrum of Pathogens by Modulating the Mitochondrial Oxidative Burst

一种线粒体RNA加工蛋白通过调节线粒体的活性氧爆发引起植物对病原菌的广谱性免疫

2. Introduction：

（1）Problem：线粒体作为细胞内能量产生和传递的细胞器，在动物免疫中发挥着重要的作用，同时细胞器内复杂的电子传递链也是ROS产生的地方，植物体内活性氧水平与抗病性息息相关。目前对mROS对植物免疫的研究较少，这种在动物中表现出来的免疫在植物中是否具有相同的表现？

（2）Aim：PPR蛋白介导的转录后修饰对线粒体编码基因的正常功能至关重要，线粒体在动物免疫中发挥重要的作用，本文探究rtp7调控植物免疫的分子机制。

3. Method：

（1）接种实验（2）组织学观察（3）VIGS（4）定量实验（5）ROS检测

4. Results：

（1）通过对野生型Col-0，rtp7-1，rtp7-3两个不同外显子插入点的突变体，过表达植株OE5和OE7，以及2个在rtp7突变背景下可显著恢复AtRTP7的互补转基因株系comRTP7-1和comRTP7-2植株进行接种实验，比较表型变化和生物学统计。AtRTP7是一种P型PPR蛋白，对植物对不同病原体的免疫产生负面调控。

（2）AtRTP7参与线粒体nad7基因转录本的RNA剪接。RT-PCR扩增nad7的转录本，发现两个突变体植株中，完全处理的nad7转录本明显低于Col-0，过表达植株与突变体表现一致，而在两个互补的转基因植株中得到恢复。同时RT-qPCR检测了Atnad7在不同材料中四个内含子的剪接效率。表明AtRTP7参与了nad7内含子1的剪接调控，但也可能在nad7内含子4的剪接中具有某些功能。

（3）由于许多PPR蛋白在线粒体C to U RNA编辑中起作用，研究AtRTP7是否也参与C to U RNA编辑。 我们在rtp7-1和Col-0中扩增了拟南芥线粒体中报道编辑的转录本，DNA测序分析显示，分别在nad1, nad3和nad6中有1, 2, 5个位点的RNA编辑水平显著降低，然而 nad1, nad3和nad6完全处理的转录本的表达和积累与Col-0无显著差异, 进一步证实了rtp7-3突变株中这些编辑位点的编辑程度也有所降低 , 而在两个互补植株中编辑程度则恢复到野生型水平。 这些位点的编辑缺失将改变nad1、nad3和nad6蛋白的二级结构。 这些结果表明，敲除AtRTP7可能对这些蛋白质的功能有很大的影响。

尽管rtp7-1突变体表现出nad1、nad3和nad6的RNA编辑改变，为了进一步检测rtp7-1的RNA编辑变化是否由nad7转录水平的降低引起，并进一步分析nad7在rtp7介导的植物抗性中的重要性，我们尝试得到nad7的突变体。在rtp7-1背景下，通过35S启动子控制下表达完全加工的nad7转录本，从而产生了转基因nad7互补株系(comnad7-5和comnad7-24)。 为了将核编码蛋白nad7靶向到线粒体， 我们将AOX蛋白的线粒体前导肽(LP)序列融合到nad7蛋白的N端，并进一步证实了在拟南芥中利用AOX先导肽靶向线粒体。与rtp7突变体相比，两个comnad7突变体的nad7转录本处理水平明显提高， 进一步从comnad7株系中扩增nad1、nad3和nad6，以确定其RNA编辑水平。 DNA测序结果表明，在comnad7株系中，nad1，nad3和nad6的RNA编辑水平显著恢复到Col-0水平。 这些结果表明这三个基因转录本RNA编辑程度的变化可能是受到rtp7转录本低积累水平引起的副作用。

（4）AtRTP7通过nad7调控植物的免疫和耐盐性

对不同材料进行NaCl处理，与互补植株想比，突变体表现出更好的耐盐性。但是过表达植株中同样也表现出耐盐性的提升。 进一步要证实nad7基因是否参与了rtp7-1突变体的抗性表型，对comnad7互补植株进行了耐盐性和耐不同病原菌性的检测。结果表明comnad7均表现出明显降低，这些结果表明，rtp7-1突变体的抗病、耐盐性和短暂发育表型是通过nad7内含子剪接受损介导的。

AtRTP7对nad7内含子1的剪接有直接影响，因此测试了nad7内含子1的剪接是否对侵染有反应。检测了nad7在接种后八个不同感染时间段的剪接效率，结果表明在侵染阶段，对intron1的剪接效率增强，表明nad7剪接参与植物病原互做。实验还发现，在OE5和OE8植株中，与未接种的植株相比，内含子1的剪接效率随着时间的增加而提高，这表明nad7的剪接效率的提高可能导致植物对病原菌的感病性增强。

（5）与野生型相比，rtp7-1突变体表现出Complex I活性缺失，线粒体ROS水平较高。RT-qPCR检测呼吸电子传递链(ETC)突变体中AOX (alternative oxidase)家族基因转录水平，该基因的表达通常被诱导清除mROS，尤其是在Complex I缺陷的植株中。分析表明，RTP7的（）缺失导致Complex I活性受损， 并且可能促进了线粒体ROS (mROS)的产生。用ROS荧光探针DCF和线粒体荧光标记MitoTracker Red显示mROS水平。 通过比较不同材料中的荧光面积，和已报道的BIR6表现相似，所以AtRTP7可能通过影响Comlex I的功能来参与mROS的爆发。

进一步研究了rtp7突变体是否在免疫相关ROS爆发中表现出改变。在flg22处理下，rtp7-1和rtp7-3与野生型叶片相比表现出较高的ROS水平，过表达OE中显示ROS爆发降低。 与rtp7-1突变株相比，comnad7和comRTP7突变株的ROS爆发减少。结果表明AtRTP7参与了PTI诱导的ROS爆发, rtp7突变体中增强的ROS可能是由功能受损的nad7蛋白引起的。 同样使用线粒体荧光标记MitoTracker Red， 观察到flg22激活mROS的产生。 进一步比较了flg22处理各种材料后mROS水平的变化，AtRTP7缺失增强了PTI相关的mROS爆发，这种表型是由nad7缺失引起的。

（6）rtp7-1对寄生蜂的抗性增强需要mROS

使用mROS特定的清除剂MitoTEMOPL 和一般的活性氧清除剂N-acetyl-cysteine (NAC)后对叶子注射病原菌，结果表明mROS和ROS参与了对病原菌的抗性，而rtp7突变体中抗性的增强需要较高水平的mROS和总ROS。

（7） 质膜定位的NADPH氧化酶不是介导rtp7-1突变体抗性增强的关键因素

定量实验结果表明，与Col-0相比，rtp7-1突变体中RBOHD和RBOHF没有变化。 rbohD或rbohD/F突变体比Col-0更容易感病。rbohD rtp7-1双突和 rbohD rbohF rtp7-1三突结果表明，AtRTP7突变进一步增强了rbohD或rbohD/F背景下的植物抗性。通过观察这些材料中的活性氧变化，这些结果表明，mROS在植物免疫中的爆发是独立于RBOHD和RBOHF的。

（8）SA通路在rtp7-1突变体中被诱导

定量检测SA通路中marker基因（PR1, CBP60g和PAD4 ）变化，发现SA信号被诱导。用清除活性氧的对照表明ROS的变化与marker基因的变化相关。以flg22侵染，在rtp7-1突变体中观测到更多的胼胝质沉淀和PTI过程marker基因的激活，表明rtp7突变体具有增强的PTI反应。

（9）RTP7在不同植物中具有保守的免疫功能

Discussion：

（1）亮点：线粒体作为细胞内能量产生和传递的细胞器，在动物免疫中发挥着重要的作用，同时细胞器内复杂的电子传递链也是ROS产生的地方，植物体内活性氧水平与抗病性息息相关。本研究逻辑清晰，各种表达材料齐全，论证的论据很全面，将植物免疫的ROS和线粒体mROS分开，独立研究mROS。

（2）建议：有研究报道线粒体在真菌侵袭部位周围聚集并被固定，这可能是由于mROS促进了植物免疫。进一步研究植物中mROS与非线粒体ROS信号转导之间的可能联系。以及AtRTP7在平衡SA对mROS与SA在植物免疫调节中的潜在作用

（3）不足：文章只研究各种转录本数量变化，RTP7对Complex I亚基修饰机制并没有阐明，可能是未来研究的方向，其中是否包含中间蛋白和过程尚未明确。整个细胞的ROS的变化是动态的，实验用不同的ROS清除剂来将mROS和ROS分开研究是否会受到影响保留意见。

Conclusion：

借助模式植物—疫霉菌亲和互作体系，通过抗病突变体鉴定和分析植物免疫负调控因子，研究植物对疫霉菌感病的遗传基础，探索抗病育种新策略。研究成功鉴定获得多个植物免疫负调控因子，命名为RTP（RESISTANCE TO PHYTOPHTHORA PARASITICA）基因。其中RTP7编码一个PPR蛋白，结合免疫功能分析，确认了RTP7是一个新的植物免疫负调控因子。通过遗传学、细胞生物学方法结合接菌分析，发现质外体ROS不是rtp7突变体抗病的关键机制，高水平mROS是rtp7抗病突变体表现更强抗性的关键因素。进一步研究表明RTP7可能通过ROS调控SA信号通路转导，RTP7和SA信号通路之间存在反馈调控，同时RTP7通过调控nad7负调控植物对番茄灰霉菌等多种不同类型病原菌的抗性。