亲和层析纯化抗体，如何减少洗脱后中和沉淀的出现？

随着亲和层析技术的发展，蛋白纯化技术相对简单，蛋白纯化技术的应用也越来越普遍，一步亲和层析即可达到90%以上的纯度。然而，蛋白纯化的过程中各个环节不容忽视。样品处理，纯化介质的选择，纯化方法的考虑，等等，虽然纯化方法简单，但是蛋白不同，采用的纯化体系也不尽相同。只要达到最终的纯化目的就是最好的纯化方法。

对于亲和层析纯化抗体，不论是蛋白A/G还是特异性抗原亲和层析，酸洗脱峰后一般加Tris中和。因为蛋白长期在酸性条件下易水解。但有一个问题就是中和容易产生沉淀。这是为什么？是抗体变性了？如何才能避免这种情况呢？

这种沉淀主要是因为洗脱时的酸性条件导致抗体变形，而在中和的时候，pH的剧烈变化更易导致抗体的变性。沉淀发生的另一个重要原因是宿主蛋白等杂质含量偏高。这类杂质在中和的时候容易导致溶液浑浊进而引发抗体沉淀。

要减少沉淀的发生应该从几个方面入手：

（1）尽量提高洗脱液的pH值。了解蛋白pH稳定性，包括低pH的稳定性，以及抗体的溶解度。如果pH稳定性低，最好使用Mabselect Sure探索高PH洗脱（PH5.0，4.0，3.0），都可以去尝试。高PH可以洗脱的，尽量不要选择更低的PH。

（2）尽量减少宿主蛋白。可以在亲和层析之前经过深层过滤，絮凝沉淀，超滤等方法去掉一些宿主蛋白类杂质。另外优化亲和层析时的中间洗涤步骤，尽量更多的去除宿主蛋白。当然不同批次的料液，其宿主蛋白的含量有所不同，因此需要加强监控，控制好亲和层析上柱前的料液中HCP的含量。最好在上样后加wash 洗HCP，PH 6左右加添加剂wash更换）。另外，也有一些介质本身的HCP的非特异吸附（这种情况在文献中提到， agrose的非特异吸附少）

（3）同时可以添加一些尿素等变性剂以提高洗脱液的洗脱能力；也可以添加精氨酸等蛋白稳定剂，以减少蛋白的变形；也可以改善中和条件，中和用的tris溶液的浓度和用量不要太高（常用的是5%体积的1M tris）。如果是溶解度低的蛋白，适当降低亲和层析进样量；样品处理和纯化过程中，尽量保持较低的温度 (4-8℃)。

（4）一般提纯后的蛋白，无论是溶液还是冻干，都是需要添加甘油或者醇类，糖类作为蛋白稳定的保护剂, 以免出现沉淀。

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