稀有密码子对蛋白表达有什么影响？

摘要外源基因中的稀有密码子是影响大肠埃希菌(大肠杆菌)表达的重要因素。稀有密码子尤其是串联稀有密码子能降低甚至耗竭胞内同源tRNA,降低蛋白表达水平,并具有显著的位置效应。另外,稀有密码子可以引起外源mRNA翻译过程中的移码翻译、核糖体跳跃和氨基酸错配等异常事件。本文就稀有密码子影响大肠杄菌蛋白表达的机制研究作一糸统综述。

在所有生物的基因中,对同义密码子的使用都不是随机的,不同的生物对同义密码子的选择有着不同的偏性。对大肠杆菌基因密码子使用频率分析表明,几乎所有简并密码子家族都对其中一个或两个密码子有偏性,高表达基因比低表达基因的密码子偏性更显著。同义密码子的使用频率与细胞内同源tRNA的相对数量有直接关联,通常反映出其同源tRNA的浓度。

很多外源基因尤其是真核基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,这些稀有密码子的存在是很多外源基因不能在大肠杆菌得到高效表达的原因之一。目前有关稀有密码子的研究主要限于精氨酸稀有密码子AGA/AGG,究主要限于精氨酸稀有密码子AGA/AGG,子。本文就有关稀有密码子影响大肠杆菌蛋白表达的机制研究作一系统综述。

一、稀有密码子的解码速率

核糖体在稀有密码子位点翻译速率降低的发现最早来自于对分泌蛋白内称之为暂停位点的研究12。在这些蛋白的跨膜运输过程中,在暂停位点存在不完全多肽中间物,研究发现暂停位点由几个稀有密码子组成。这是由于稀有密码子的同源tRNA丰度很低,在核糖体的A位以随机方式寻找与稀有密码子配对的同源氨酰tRNA需要花费比偏性密码子更长的时间,导致多肽延伸的翻译速率降低。蛋白合成速率由翻译起始速率(Ri)和核糖体在mRNA的移动速率所决定通常偏性密码子的解码速率(Ra)与稀有密码子的解码速率(Rb)都在大于Ri,因而对蛋白合成速率并无影响。只有在某些条件下当稀有密码子的同源tRNA供应不上时,Rb就会大大低于Ri,引起核糖体停在稀有密码子处,并阻碍了随后的核糖体蛋白合成mRNA上形成核糖体串,这串核糖体的数目由Ra和Rb的速率比所决定。

二、串联稀有密码子对蛋白表达的抑制

对AGA/AGG密码子的研究结果表串联AGA/AGG能显著降低蛋白表达水平,分散的AGA/AGG对蛋白表达水平影响不大,因而对蛋白表达的抑制作用并不完全,依赖于特异基因中某种稀有密码子的数量。将(AGG)4和( GCGAGG)6插入氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因同一位点,当基因转录速率不超过一定限度时,两者表达水平基本相同。当基因转录速率超过一定限度时,插入串联(AGG)4的CAT基因表达水平急剧下降,而插入( GCGAGG)5的CAT基因表达水平则继续升高当靶基因的mRNA转录达到一定水平,串联AGG密码子能够引起RNAAGA/的占据效应,耗竭细胞内游离的RNAA0MAC°,AGG的解码速率大大降低。当核糖体在解码AGG密码子时,肽酰tRNAmRNA-核糖体三元复合物中P位RNAAGA/A的释放有赖于其下一个密码子的迅速解码,当下一个密码子也是AGG时tRNA0MA在P位上被占据的时间就会大大延长。如果基因转录速率超过一定限度,过多的mRNA上的串联AGG密码子就会完全占据胞内稀有的tRNA00,A位的AGG密码子无法解码,P位占据的tRNA GA/AO不能释放,导致基因表达停止。但只要未达到转录的限制速率,那么tRNAAGA/A浓度的降低保持在一个中等水平就不会限制蛋白表达,这表现为随着转录速率的提高出现蛋白表达的“全或无”效应;而分散的AGG密码子则不会产生占据效应,P位的 trNA随着下一个密码子的迅速解码能够很快释放,因而对胞内的tRNAA0AAc浓度不会有太大影响。但也有文章与该规律不一致。如hGM-CSF只有一个AGG,与编码tRNA400M的argU基因共表达后表达量能提高3~4倍。 Calderone等将一个含有4个分散AGA/AGG的156个氨基酸融合蛋白基因的3个AGA都突变为大肠杆菌偏性的CGC,表达量提高了2~3倍￥”。在大肠杆菌中表达牛胎盘催乳激素时,基因内有9个分散的AGA/AGG密码子,改变其中5个AGA/AGG密码子偏性,使蛋白表达水平由低于10%提高至30码子是为了在翻译起始区避免二级结构,以获得更有效的翻译起始。但这种假说不能解释一些现象首先是稀有密码子的位置效应,有时一个单独的稀有密码子就能降低蛋白表达水平第二,这个抑制效果不是二级结构所形成,因为只有在基因转录速率达到一定水平才会有显著抑制作用;另外这种抑制作用能被稀有tRNA的过量表达所克服。第三,通过在起始峦码子附近插入连续重复序列产生广泛二级结构,并没有降低基因的表达水平2),另外一种假说认为基因起始处的稀有密码子可以导致核糖体暂停,以便更有效地容许新生肽链折叠。

AGA/AGG高含量基因表达引起的tRNAVA/耗竭可以导致细菌存活力和质粒稳定性降低,已表明 tRNA GAY与细菌中DNA复制相关蛋白的表达有关。可能是这些蛋白起始位点附近含有AGA/AGG密码子,当 tRNA耗竭后,使这些基因不能得到有效表达,抑制了核酸复制和细菌生长

四、移码翾译、核糖体跳跃和氨基酸错配

移码翻译是蛋白翻译过程中几个异常事件的综合结果,是指核糖体在翻译过程中改变其阅读框架,向+1或-1方向移动一个核苷酸,导致一种新的多肽或蛋白质的合成。

虽然移码翻译的机制各不相同,但存在些共同之处。首先是翻译过程中必须发生核糖体暂停。第2个共同点是移码翻译需要肽酰-tRNA的重新配对,也就是核糖体选择的同源tRNA能与移码后的另一个密码子配对或接近配对,稀有密码子引起的移码事件可以严重影响外源蛋白表达的质量和数量。 spanjaard等发现A-AGG-AGG-U序列能够产生50%的核糖体十1移码,A-AGAAGA-U也可以引起高效移码,将表达tRNA4AA的基因共表达或将AGA/AGG改为大肠杄菌偏性密码子都可以抑制移码翻译的发生,表明这个移码翻译是由tRNA0M缺乏引起的AGA/AGG解码错误造成的1, vilboils等在大肠杆菌表达人可溶性儿茶酚-0-甲基转移酶( hCOMT)时发现在最后一个密码子CCC处产生+1移码,除 hCOMT外,得到一个C末端多了11个氨基酸的蛋白产物, Gursky等报道将AGG-AGG插入CAT基因终止密码子TGA之前,可引起-1移码,蛋白表达量提高了3~10倍,CAT基因的mRNA量也相应地增长,表明其基因3′端的移码翻译对mRNA降解具有保护作用19)。

稀有密码子导致的核糖体暂停还可以引起核糖体跳跃或氨基酸错配。在大肠杆菌表达牛胎盘催乳激素时,85~87位的密码子TTG-AGG-TTG处能发生核糖体跳跃事件。86位AGG引起肱酰tRNA在85位TTG暂停,肽酰tRNA能越过AGG与87位TTG重新配对,继续翻译,从而导致翻译的蛋白缺失了86和87位的两个氨基酸]。TrpLE融合蛋白在大肠杆菌表达时,其基因内部3个分散的精氨酸AGA密码子处发生36%~42%的赖氨酸高效错配,将这些稀有密码子突变为大肠杆菌偏性的CGC后,错配事件就不再发生”。这是由于赖氨酰tRNA的反密码子TTT与AGA密码子有一定程度的配对能力,当 tRNA0M°供应不上时就容易导致错配事件的发生。

五、结语

虽然目前还没有一个规则能预测特定基因中稀有密码子能否阻碍基因在大肠杆菌的表达,但通过对AGG稀有密码子的研究,人们已经获得稀有密码子抑制基因表达的一些规律。文献中有时出现不一致结果可能是由于多个因素不同的综合结果所致,如位置效应、稀有密码子的聚集或分散存在、mRNA的二级结构和其他效应等。稀有密码子对基因表达的抑制作用可用两种方法消除。首先是改变密码子的偏性,通常外源基因的稀有密码子很多,有的采用全合成基因的方法,有的仅通过改变基因5′端的密码子偏性就可以获得在大肠杆菌的高效表达,如绵羊生长激素和人异酰辅酶A脱氢酶在大肠杆菌的表达;其二是用编码外源基因中的较多稀有密码子的同源tRNA基因共表达的方法来获得高效表达。编码 tRNAGA或trNA基因的共表达使一些外源基因在大肠杆菌得到高效表达(1)。随着在大肠杆菌表达的基因数目的不断增多,人们对稀有密码子的认识将会越来越深入,这对外源基因在大肠杆菌表达及了解稀有密码子在基因进化中的作用具有重要意义。

稀有密码子分析工具：（www.detaibio.com/tools/rare-codon-analyzer.html）