如何预测LncRNA的靶基因？

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正因为LncRNA有这么多重要的功能，所以寻找LncRNA靶基因挖掘它对基因表达、蛋白合成各方面的调控作用就成了LncRNA研究的关键。

LncRNA靶基因的预测，可大致分三种情况：

3.1 已知gene symbol的LncRNA

对已知gene symbol 的LncRNA，可以直接通过软件数据库例如starBase，ChIPBase，NONCODE等，利用gene symbol搜索其相关信息。这里我们以starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）为例做演示。

打开starBase首页，点击进入Protein-RNA，选择protein-lincRNA interactions点击进入。

进入下图界面，在搜索框输入想了解的LncRNA symbol，例如“HOTARI”点击搜索。

然后就可以看到下图的结果，得到“HOTAIR”可能的靶向蛋白。

3.2 新发现的LncRNA

目前现有数据库物种信息十分有限、数据信息也较少，所以对于转录本预测出的没有symbol号的新LncRNA，由于LncRNA对靶基因没有固定的作用模式，基因调控可能以顺式（cis）或反式（trans）作用发生。所以，我们可根据不同作用方式分别进行预测。

3.2.1 cis作用靶基因预测

图1.Cis调控作用

RNA聚合酶（绿）转录得到一个与调控蛋白（紫）相关的LncRNA（红）从而影响附近区域的编码基因。

cis作用靶基因预测，认为LncRNA的功能与其坐标临近的蛋白编码基因相关，位于编码蛋白上下游的LncRNA可能与启动子或者共表达基因的其他顺式作用元件有交集，从而在转录或者转录后水平对基因的表达进行调控。判断一个LncRNA具有Cis调控作用通常要同时满足以下几个条件：

1. 附近的基因表达情况与其保持一致；
2. 该基因失活后会影响周围基因的表达；
3. 会影响附近同一位点的基因表达。

对于满足以上条件的LncRNA，首先找出位于其上游或者下游附近（10K）的编码蛋白基因，通过对编码蛋白的功能富集分析，从而预测LncRNA的主要功能，为后续Cis作用分析打下基础。

图2.LncRNA上下游分析示例

3.2.2 Trans作用靶基因预测

图3.Trans调控作用

LncRNA（红）与DNA结合蛋白（蓝）相关联，并调控相关靶基因的表达。

Trans作用靶基因预测基本原理认为LncRNA的功能跟编码基因的位置关系没有关系，而与其共表达的蛋白编码基因相关。也就是说，当LncRNA与一些距离较远的基因在表达量上存在正相关或负相关的情况时，就可以通过样本间lncRNA与蛋白编码基因的表达量相关性分析或WGCNA共表达分析来预测其靶基因。

需要注意的是，lncRNA的Trans作用靶基因预测只适合于样本量大的情况，如果样本量太少（如6个以下），分析将不可靠。

图4.lncRNA-mRNA共表达网络图分析示意图

3.3 LncRNAantisense分析

除了Cis作用和Trans作用调控，LncRNA参与调控许多转录后进程时，与miRNA和snoRNA等小RNA类似的，这些调控往往与碱基的互补配对有关。一部分反义LncRNA可能因为与正义链的mRNA结合而调控基因沉默、转录及mRNA的稳定性。所以，LncRNA的antisense分析，可以利用软件（如RNAplex）预测反义LncRNA与mRNA之间的互补配对关系，根据热力学结构计算最小自由能来预测最佳碱基配对关系。

图5.LncRNA antisense分析示例图

图5展示了最佳LncRNA-mRNA结合位点以及反义LncRNA与其共表达基因间的最小自由能。通过最小自由能的比较，预测LncRNA的靶基因。

4、后续功能验证

根据以上分析结果，选取目标LncRNA，进行后续实验验证（多点QPCR验证LncRNA与mRNA的相关性、基因known down等技术）。

包括：

• 功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体。
• 功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响。
• 免疫共沉淀研究：可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
• 表达调控：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA调控机理。
• 转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。
• 染色质重塑：lncRNA表观调控。
• ceRNA机制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之间的调控机制。