HRP标记抗体原理及方法（戊二醛二步法和过碘酸钠法）
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酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 (一) 酶制剂及其底物 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求： (1)来源方便，易于纯化； (2)比活性高，性质稳定； (3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O 供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。 由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物颜色。 (二) HRP标记抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法 1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤： (1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。 (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定： (1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。 (2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量 克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4 40,000 160,000 IgG量 (3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的 酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材： (1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml， NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 (2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。 (3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 (4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 (5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 (7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。 (8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。 (9) HRP(RZ>3.0)。 (10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。 (11) 搅拌器，分光光度计，离心机。 (12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。 简易过碘酸钠法 本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。 1. 原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 2. 标记步骤: (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。 (3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。 (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化�RP的PH升高到9.0～9.5，然后立 即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小 时。 (5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。 (6) 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。 其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。 3. 结果判定： 除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。 IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62 4. 试剂及器材: (1) 0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。 (2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液: 0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml 0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml 加蒸馏水至2,000ml。 (3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液: Na２CO３ 0.32克 NaHCO３ 0.586克 加蒸馏水至50ml 再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。 (4) NaBH４溶液(4mg／ml): 临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。 (5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。 (三) 工作浓度的选择 在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。 酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。 其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600⋯⋯(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４ 0.05ml终止反应。 结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。 有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。 要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。 (四) 注意事项 1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。 2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。 3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。 4. 浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。
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