荧光标记的选择与标记方法指南

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荧光标记的选择指南： 对于流式检测最初的一步就是选择何种方法，通常是何种荧光物质标记的抗体。厂家根据需要开发了各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测，各单位买的流式仪功能不完全一致，首先要和检测方进行联系，看能否检测。在附表里我将常用的荧光标记物质的激发波长和检测波长给出，可以参考。有几个原则一起说一下：

1、流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接发，即二抗上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往会不同程度影响检测结果。

2、厂家推出的抗体有一些明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、western等，首选前者，可以保质保量，但是后者并不是不可以用，一般来说如果没有明确的表明适合流式检测的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结果不一定非常理想。

3、单抗和多抗均可应用。

4、绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，我也曾碰到几次有人将转了绿色荧光蛋白的细胞再采用FITC标记的抗体来检测目的蛋白（据说还有人用此方法得出了满意的结果！），岂不知绿色荧光蛋白和FITC是一个荧光通道，更本不能一起检测。

5、如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。我自己比较倾向于多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流式仪的各种参数。

免疫荧光单标记和双标记的方法

1. 免疫荧光单标记方法 免疫 荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。 1)所需材料与试剂 (1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。 (2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。 (3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。 (4)封闭液。 (5)0．01mol／LPBS缓冲液。 2)染色方法 (1)取出培养有细胞的盖玻片或glass―bottom培养皿，用0．01MPBS洗2―3遍。 (2)加入0．3％的TritonX―100，37℃，30rain。 (3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。 (4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。 (5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。 (6)0．3％TritonX―100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。 (7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗，37℃，孵育1h。 (8)0．3％TritonX―100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。 (9)90％甘油(PBS配制)封片。 (10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。 2．免疫荧光双标记方法 免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。其次，两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠，且尽量远离，通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下，染色时两种一抗可以同时孵育，然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。 3．样品制备注意事项 (1)在进行免疫荧光标记时，如样品的来源为组织，应采用冷冻切片。 (2)样品制备应满足一般荧光显微镜观察的要求。 (3)尽量去除非特异性荧光信号。细胞经荧光染色后可能会产生自发荧光，可用PBS取代一抗作为对照，以区分自发荧光和阳性结果。 (4)为了不将细胞压扁，盖玻片与载玻片之间的介质多用甘油与PBS混合液(9：1)封片，甘油还有抗荧光淬灭的作用。同时还应注意封片时避免产生气泡。 (5)用指甲油将盖玻片四周封片，注意避免将细胞压扁。 (6)为防止荧光淬灭，可在介质中加入抗氧化剂DABCO(100mg／mi)，室温，密封可保存6个月；或苯二胺(100mg／mi)，-20℃，保存2～3周。 更多阅读：德泰生物抗体标记实验操作（http://www.detaibio.com/topics/antibody-labeled.html）